Technologia inaktywacji i usuwania wirusów z produktów krwiopochodnych

Produkty krwiopochodne to „składniki białek osocza lub składniki komórek krwi, takie jak albumina krwi ludzkiej, immunoglobulina ludzka, koncentrat ludzkiego czynnika krzepnięcia (naturalnego lub rekombinowanego) krwinek czerwonych itp., oddzielone od zdrowego ludzkiego osocza lub specyficznie odpornego osocza ludzkiego, oczyszczone lub wytworzone przy użyciu technologii rekombinacji DNA, do diagnostyki, terapii lub biernej immunoprofilaktyki”. Produkty krwiopochodne odgrywają ważną rolę w ratownictwie medycznym, ratowaniu ofiar wojennych oraz zapobieganiu i leczeniu niektórych specyficznych chorób.

 

Tło regulacyjne

Praktyki zapewniania bezpieczeństwa muszą gwarantować, że końcowy lek będzie bezpieczny dla organów regulacyjnych, a ostatecznie dla pacjentów i społeczeństwa. W latach 90. Międzynarodowa Konferencja Koordynacyjna (ICH 1998) wydała dokument „Q5A: Ocena bezpieczeństwa wirusów produktów biotechnologicznych pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego” (Q5A: Ocena bezpieczeństwa wirusów), ustanawiając światowy standard bezpieczeństwa wirusów.

ICH Q5A opisuje wielopoziomowy schemat testowania i sprawdzania poprawności, aby osiągnąć ten cel. Program testów skupia się na zbieraniu banków komórek, surowców i bioreaktorów, uzupełnionych analizą ryzyka produktu. Oprócz testowania, ICH Q5A wymaga, aby odkażanie w dalszej części instalacji zostało ocenione jako niezawodny środek, gdy nie zostaną wykryte żadne zanieczyszczenia powyżej. Weryfikacja klirensu gwarantuje, że jeśli jakikolwiek wirus ominie reżim testowy, będzie można go usunąć i/lub inaktywować, zanim trafi do końcowego produktu leczniczego.

 

Kontekst ogólnego programu ochrony antywirusowej

We współczesnej produkcji biotechnologicznej (lub bioprzetwarzaniu) w całej oczyszczonej sekwencji występują zwykle trzy lub cztery operacje jednostkowe, które umożliwiają usunięcie lub inaktywację wirusa. Obejmuje to pewne etapy chromatograficzne (takie jak białko A lub wymiana anionowa), hodowlę o niskim pH lub detergenty oraz filtry zatrzymujące wirusy. Nie wszystkie te kroki skutecznie usuną lub dezaktywują wszystkie wirusy.

Na przykład hodowla o niskim pH jest zwykle nieskuteczna w przypadku inaktywacji wirusa bezotoczkowego, ale działa dobrze w przypadku inaktywacji wirusa otoczkowego. W pewnych warunkach pracy kolumna anionowymienna może nie być w stanie związać i usunąć obojętnych wirusów izoelektrycznych ze strumienia produktu, ale jest skuteczna przeciwko wirusom kwasowym.

Jest to połączenie trzech do czterech niezależnych i ortogonalnych operacji jednostkowych, które razem zapewniają bezpieczeństwo wirusowe produktów biotechnologicznych.

 

Ogólnie zakłada się, że solidny, wydajny i niezawodny etap przetwarzania będzie w stanie usunąć lub inaktywować dużą liczbę wirusów (zwykle definiowaną jako 4 log10 lub większą, gdzie wartość redukcji log lub LRV jest obliczana jako log10 całkowitej liczba wirusów na wejściu podzielona przez całkowitą liczbę wirusów na wyjściu). Jednakże LRV nie może być stosowany jako pojedyncza bezwzględna miara skuteczności kroku. Dane mogą być wstępne. Jest łatwy do modelowania, stosunkowo niewrażliwy na zmiany warunków procesu i skuteczny wobec szeregu wirusów (WHO 2004).

Filtracja wirusowa jest powszechnie uznawana za potężny i skuteczny etap procesu i stanowi kluczowy element ogólnej strategii minimalizacji ryzyka obecności egzogennych i endogennych cząstek wirusowych podczas wytwarzania produktów biotechnologicznych.

Filtry wirusowe często działają poprzez silne mechanizmy zatrzymywania oparte na rozmiarze. W oparciu o ten potężny mechanizm działania, filtry wirusowe z większym prawdopodobieństwem niż etapy chromatograficzne zapewnią przewidywalną retencję szeregu wirusów. Dzieje się tak dlatego, że filtr jest mniej podatny na różnice we właściwościach fizykochemicznych różnych wirusów oraz interakcje wirus-żywica regulowane przez warunki pracy. Dlatego też etap filtracji wirusowej jest powszechnie stosowany w dobrze zaprojektowanych procesach oczyszczania rekombinowanych białek terapeutycznych (EMEA 1996), które, jak wykazano, charakteryzują się również solidną wydajnością w przemyśle przetwarzania plazmy.

 

Jednak produkty krwiopochodne są jak miecz obosieczny, który nie tylko ratuje tysiące istnień ludzkich, ale także ma możliwość rozprzestrzeniania chorób i stwarzania zagrożenia dla zdrowia ludzkiego. Według statystyk w latach 1977–1984 co najmniej 30000 biorców krwi w Stanach Zjednoczonych otrzymało krew zakażoną wirusem AIDS. W 1985 r. 1200 na 3000 chorych na hemofilię we Francji zostało zakażonych AIDS w wyniku transfuzji krwi lub produktów krwiopochodnych.

Według Światowej Organizacji Zdrowia od 5% do 10% zakażeń AIDS na całym świecie jest spowodowanych transfuzjami krwi lub produktów krwiopochodnych zakażonych AIDS. Pierwszy przypadek AIDS w Chinach został zakażony importowanymi produktami krwiopochodnymi zakażonymi wirusem AIDS. Ponadto zgłaszano również przeniesienie chorób wirusowego zapalenia wątroby typu B i C w wyniku transfuzji krwi i produktów krwiopochodnych.

 

1. Główne wirusy przenoszone przez produkty krwiopochodne i ich charakterystyka

Istnieje wiele rodzajów wirusów przenoszonych przez krew i produkty krwiopochodne, jak pokazano w tabeli 1. Wśród nich krajowe i zagraniczne kręgi medyczne interesują się wirusami HIV, HBV i HCV ze względu na ich wysoki wskaźnik infekcji i poważne szkody.

Ponieważ krew i produkty krwiopochodne mogą rozprzestrzeniać wirusy, poważnie wpływa to na jej zastosowanie w profilaktyce i leczeniu chorób. Dlatego też przy produkcji produktów krwiopochodnych należy uwzględnić procesy inaktywacji i usuwania wirusów, aby zapewnić bezpieczeństwo produktów krwiopochodnych.

2. Główne metody inaktywacji i usuwania wirusów

Aby zapewnić bezpieczeństwo produktów krwiopochodnych, oprócz selekcji dawców krwi, w miarę możliwości szczepień, rygorystycznych badań pobranej krwi i innych środków, ważnym ogniwem zapewniającym bezpieczeństwo transfuzji krwi. Poniżej opisano szczegółowo kilka powszechnie stosowanych i skutecznych metod inaktywacji i usuwania wirusów.

 

I. Metody inaktywacji wirusów

1. Metoda Pasteura

Teoretyczną podstawą tej metody jest to, że szybkość niszczenia struktury wirusa jest znacznie większa niż struktury białka poprzez dobór temperatury i czasu działania. Prawie 50 lat wyników zastosowań klinicznych i ostatnie doświadczenia na zwierzętach potwierdziły, że albumina w roztworze po 60-stopniowej i 10-godzinnej obróbce cieplnej, czyli dezynfekcji Pasteura, może nie tylko inaktywować HBV, ale także inaktywować HCV i HIV, czyniąc albuminę najbardziej niezawodną produkt krwiopochodny pod względem bezpieczeństwa wirusologicznego.

Ostatnio proces Pasteura został rozszerzony o wytwarzanie IVIG, FVI, FIX, fibrynogenu i innych produktów. Bridonnccu i in. dodano ten proces inaktywacji wirusa do procesu IVIG produkcji etanolu w niskiej temperaturze, to znaczy metodę Pasteura wdrożono w warunkach braku stabilizatora, niskiej zawartości soli i kwasowości, a miano wirusa spadło o 5 log. Simmonds i in. zbadał wirusa przenoszonego przez transfuzję (TTV) skoncentrowanych preparatów FVⅢ i FIX stosowanych klinicznie w Wielkiej Brytanii i stwierdził, że wskaźnik wykrywalności TTV produktów bez inaktywacji wirusa Pasteura wynosił od 50% do 75%, a wskaźnik wykrywalności pozytywnej produktów po inaktywacji Pasteura wynosiła 0.

Odsetek dodatni TTV wyniósł 27% u 84 pacjentów z hemofilią w Wielkiej Brytanii, którzy stosowali produkty zawierające nieinaktywowane czynniki krzepnięcia, podczas gdy tylko 1 z 19 pacjentów stosujących produkty zawierające czynniki krzepnięcia inaktywowane wirusami uzyskał wynik dodatni, a wskaźnik wykrywalności dodatniej wynosił 5%. Dlatego proces inaktywacji wirusa jest bardzo skuteczny w poprawie bezpieczeństwa produktów krwiopochodnych.

 

2. Rozpuszczalnik organiczny połączony ze środkiem powierzchniowo czynnym (metoda S/D)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Duża liczba produktów krwiopochodnych inaktywowanych metodą S/D, w wyniku długotrwałego zastosowania klinicznego, okazała się bezpieczna i niezawodna, dlatego są one szeroko stosowane. Jednakże metoda ta nie ma zdolności inaktywacji wobec parwowirusa B19, HEV i innych wirusów niepokrytych liposukcją.

 

3. Metoda inaktywacji suchym ciepłem

Inaktywacja suchym ciepłem oznacza, że ​​liofilizowany preparat poddaje się obróbce przez ogrzewanie, a wirus zostaje zabity przez suche ciepło. Powszechnie stosowane metody suchego ogrzewania to metoda ogrzewania 60 stopni ~ 80 stopni, 10 ~ 72 godzin i metoda obróbki 80 stopni, 72 godziny. Już na początku lat 80. XX wieku przydatne było ogrzewanie liofilizowanego stężonego preparatu FVIII i kompleksu protrombiny w temperaturze 60–80 stopni przez 10–72 godziny. Udowodniono jednak, że metodą tą nie można całkowicie inaktywować HBV, HCV, HIV. Udowodniono, że obróbka cieplna na sucho w temperaturze 80 stopni i przez 72 godziny jest skuteczna w inaktywacji HBV, HCV i HIV. Ostatnio pojawiły się także doniesienia o liofilizowanych preparatach czynników krzepnięcia poddawanych obróbce w temperaturze 100°C. Xu Jinbo i wsp. leczyli IgG w 100 stopniach przez 30 minut i inaktywowali wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej 8,2 Log. Niektórzy ludzie zamrażają liofilizowany FVIII w temperaturze 68 stopni przez 72 godziny, w stanie suchym, a następnie ogrzewają w temperaturze 100 stopni przez 0,5 ~ 1 godzinę. Metoda ta jest stosunkowo ekonomiczna.

 

4. Metoda fotochemiczna

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6,6 Log komórek związanych z wirusem HIV i płytek krwi pozostał dobry po 7 dniach funkcjonalnego zachowania in vitro, co zostało zatwierdzone przez FDA do badań klinicznych.

Wśród tych metod metoda dezynfekcji Pasteura i metoda S/D zostały zatwierdzone przez amerykańską FDA i są szeroko stosowane na świecie. Metoda inaktywacji suchym ciepłem jest odpowiednia głównie do inaktywacji wirusów preparatów liofilizowanych. Metoda fotochemiczna ma silny wpływ inaktywujący na wirusy pokryte lipidami i była stosowana w Europie do inaktywacji wirusów w osoczu pełnym i ma szerokie perspektywy inaktywacji wirusów w składnikach komórek krwi. Jednakże wszystkie te metody mają swoje wady, takie jak sterylizacja Pasteura nie jest idealna do inaktywacji niektórych wirusów odpornych na ciepło; Metoda S/D nie mogła skutecznie inaktywować wirusa niepowleczonego lipolizą. Metoda fotochemiczna znacząco uszkodziła aktywność niektórych białek osocza. Obecne kliniczne zastosowanie badań kontrolnych pokazuje, że żadna metoda inaktywacji wirusów nie może zagwarantować, że produkty krwiopochodne są całkowicie wolne od ryzyka przeniesienia wirusów.

 

I. Proces usuwania wirusa

Podczas wytwarzania produktów krwiopochodnych jeden proces inaktywacji nie może unieszkodliwić wszystkich wirusów; Ponadto sam wirus jest białkiem heterologicznym, dlatego wejście do produktu spowoduje reakcje niepożądane; Jednocześnie, ze względu na ograniczenia poziomu technicznego, nadal istnieją wirusy, których właściwości nie zostały odkryte lub poznane, zatem istniejące metody inaktywacji wirusów nie mogą zagwarantować efektu inaktywacji tych wirusów. Dlatego sama inaktywacja nie może zagwarantować bezpieczeństwa produktu i należy go usunąć z produktu. Dlatego technologia usuwania wirusów cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Poniżej krótko opisano dwa powszechnie stosowane i skuteczne procesy usuwania wirusów.

1. Technologia chromatograficzna

Technologia chromatograficzna odnosi się do stosowania różnych składników i powinowactwa fazy stacjonarnej lub różnic interakcji w celu uzyskania rozdziału różnych składników. Jako zaawansowana technologia wytwarzania produktów krwiopochodnych, sama chromatografia ma działanie usuwające wirusy, zwłaszcza chromatografia powinowactwa i chromatografia jonowymienna. W przypadku chromatografii jonowymiennej elucja ma przewagę nad penetracją w usuwaniu wirusów. Tabela 2 przedstawia dane statystyczne dotyczące szybkości usuwania HAV metodą chromatograficzną w procesie produkcji albumin przez firmę CSL w Australii. Jak widać z Tabeli 2, chromatografia jonowymienna i filtracja żelowa są bardziej skuteczne w usuwaniu HAV, przy całkowitej szybkości usuwania wynoszącej 10,9 log.

Podczas produkcji FVIII firma Baxter Healtheare przeprowadza chromatografię powinowactwa immunologicznego przy użyciu żeli traktowanych przeciwciałami anty-FVIII, które mogą usunąć (4,2±0.1)Log i (5.3±0.9)Log z substancji nie -wirusy pokryte lipidami, takie jak odpowiednio PPV i HAV.

 

2. Filtracja nanofilmowa

W przypadku niektórych wirusów o małej średnicy powierzchni, takich jak HAV i parwowirus B19, najskuteczniejszą metodą usuwania jest filtracja nanomembranowa. Wykorzystuje różnicę wielkości między białkami i wirusami oraz adsorpcję wirusów przez membranę filtra w celu izolacji wirusów. W ośrodku zaopatrzenia w krew Sanquin w Holandii przeprowadzono badanie laboratoryjne dotyczące usuwania wirusów poprzez dodanie jednoetapowej, dwustopniowej filtracji nanomembranowej Planova 15N do procesu wytwarzania kompleksu protrombiny. Stwierdzono, że szybkość usuwania HIV, HAV i innych wirusów wzrosła w różnym stopniu po filtracji nanomembranowej (patrz Tabela 3).

Jednakże w przypadku zastosowania tej metody do produkcji przemysłowej mogą pojawić się następujące problemy: Po pierwsze, ze względu na dużą lepkość produktu i obecność białek o dużej średnicy, wielkość porów membrany wybranej przez filtr nie powinna być zbyt mała, ograniczając w ten sposób usuwanie wirusów o małej średnicy, takich jak HCV; Po drugie, stabilność kontroli wielkości porów membrany w procesie produkcji filtra będzie miała wpływ na usunięcie wirusa. Po trzecie, gdy otwór membrany mniejszy niż średnica cząstki wirusa zostanie zablokowany, natężenie przepływu produktu zostanie zmniejszone, co wpłynie na wydajność. Dlatego też dobór membran, których właściwości i wielkość porów są odpowiednie do potrzeb przetwarzanych produktów, jest ważnym czynnikiem decydującym o tym, czy filtracja nanomembranowa będzie w stanie usunąć wirusy.

 

3. Dyskusja

W założeniu zapewnienia jakości źródła krwi, proces inaktywacji i usuwania wirusów jest ważnym i niezbędnym środkiem zapewniającym bezpieczeństwo produktów krwiopochodnych. Stosowanie tylko jednego inaktywowanego procesu wirusowego nie może w pełni zagwarantować bezpieczeństwa produktów krwiopochodnych. W oparciu o technologię inaktywacji wirusów dodano technologię usuwania wirusów, taką jak chromatografia i filtracja nanofilmów, znacznie wzrosła szybkość usuwania wirusów, a efekt inaktywacji i usuwania wirusów został znacznie poprawiony. Obecnie Europa wyraźnie zaproponowała, aby w procesie produkcji produktów krwiopochodnych zastosować co najmniej jedną inaktywację i usunięcie wirusów, aby zapewnić bezpieczeństwo produktów krwiopochodnych.

W Chinach większość producentów produktów krwiopochodnych stosuje w procesie produkcyjnym tylko jeden proces inaktywowanego wirusa, taki jak metoda dezynfekcji Pasteura, metoda S/D itp., ale nie stosuje procesu usuwania wirusów, który poważnie wpływa na jakość produktów krwiopochodnych. Wraz z przystąpieniem Chin do WTO proces produkcji i standardy jakości krajowych produktów z krwi będą zgodne ze światowymi, w przeciwnym razie nie będą w stanie zagwarantować istniejącego udziału w rynku krajowym, ale także nie będą mogły konkurować z podobnymi produktami w innych krajach rynek międzynarodowy.

Dlatego chińscy producenci produktów krwiopochodnych muszą usprawnić proces produkcyjny, wzmocnić inaktywację i usuwanie wirusa, aby w pełni zapewnić jakość i bezpieczeństwo produktu. Dlatego wśród chińskich producentów produktów krwiopochodnych tendencją będzie stosowanie chromatografii do oczyszczania produktów krwi i usuwania wirusów, aby zapewnić bezpieczeństwo produktów krwi.

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology to krajowe przedsiębiorstwo high-tech skupiające się na biofarmaceutykach, hodowlach komórkowych, oczyszczaniu i zatężaniu biomedycyny, diagnostyce i płynach przemysłowych. Z sukcesem opracowaliśmy urządzenia do filtrów odśrodkowych, kasety do ultrafiltracji i mikrofiltracji, filtry wirusowe, systemy TFF, filtry wgłębne, włókna kanalikowe itp., które w pełni spełniają scenariusze zastosowań biofarmaceutyków, hodowli komórkowych i tak dalej. Nasze membrany i filtry membranowe są szeroko stosowane w zatężaniu, ekstrakcji i separacji przed filtracją wstępną, mikrofiltracją, ultrafiltracją i nanofiltracją. Nasze liczne linie produktów, od małych jednorazowych filtrów laboratoryjnych po produkcyjne systemy filtracji, badania sterylności, fermentacja, hodowle komórkowe i inne, spełniają potrzeby testowania i produkcji. Guidling Technology z niecierpliwością czeka na współpracę z Tobą!