Podstawowe zasady i przebieg syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS)
Synteza peptydów na fazie stałej- (SPPS)to metoda syntezy peptydów na stałym nośniku. Główne strategie SPPS obejmująMetoda BocaiMetoda Fmoc. Synteza peptydów jest powtarzalnym procesem dodawania kolejnych aminokwasów i zazwyczaj przeprowadzana jest odC-koniec (koniec karboksylowy)doN-koniec (koniec aminowy). Najpierw grupa karboksylowa pierwszego aminokwasu docelowego peptydu jest kowalencyjnie przyłączona do stałego podłoża (żywicy). Stosując grupę aminową tego aminokwasu jako punkt wyjścia, N-końcową grupę zabezpieczającą usuwa się, a rosnący łańcuch peptydowy wydłuża się w reakcji z nadmiarem aktywowanego drugiego aminokwasu. Ten cykl-sprzęganie → mycie → odbezpieczanie → neutralizacja i przemywanie → następne sprzęganie-jest powtarzany aż do osiągnięcia pożądanej długości peptydu. Na koniec łańcuch peptydowy oddziela się od żywicy i oczyszcza w celu uzyskania docelowego peptydu. Gdy grupa aminowa - jest zabezpieczonaBoc (tert-butyloksykarbonyl), metoda ta nazywana jestSynteza peptydów w fazie stałej-na bazie Boc. Gdy grupa aminowa - jest zabezpieczonaFmoc (9-fluorenylometyloksykarbonyl), jest znany jakoSynteza peptydów w fazie stałej-w oparciu o Fmoc.
Synteza peptydów w fazie stałej-na bazie Boc (metoda Boc)
wMetoda Boca, Grupy Boc usuwalne za pomocą kwasu trifluorooctowego (TFA)służą do ochrony -grup aminowych, podczas gdygrupy zabezpieczające typu benzylowego-są stosowane w łańcuchach bocznych. Podczas syntezy Boc-chroniony -aminokwas jest najpierw kowalencyjnie połączony z żywicą. Następnie grupę Boc usuwa się za pomocą TFA i powstały wolny koniec aminowy neutralizuje się trietyloaminą. Kolejny aminokwas jest aktywowany za pomocąDCC (dicykloheksylokarbodiimid)i sprzęgnięty w celu przedłużenia łańcucha peptydowego. Po zakończeniu składania docelowy peptyd jest odszczepiany od żywicy, zazwyczaj przy użyciu mocnego kwasubezwodny fluorowodór (HF)Lubkwas trifluorometanosulfonowy (TFMSA)W metodzie syntezy Boc wymagane jest wielokrotne traktowanie kwasem w celu usunięcia grup zabezpieczających przed każdym etapem sprzęgania. Może to prowadzić do kilku reakcji ubocznych, takich jak przedwczesne odszczepienie peptydu od żywicy i niestabilność łańcuchów bocznych aminokwasów w warunkach kwasowych, co powoduje niepożądane reakcje uboczne.
Synteza peptydów w fazie stałej-na bazie Fmoc (metoda Fmoc)
W1978, Meienhofera i Athertonaopracował strategię syntezy peptydów przy użyciuFmoc (9-fluorenylometyloksykarbonyl)jako -grupa zabezpieczająca grupę aminową, znaną jakoMetoda Fmoc. W tym podejściu grupa aminowa -jest zabezpieczonazasadowy-labilny Fmoc, natomiast łańcuchy boczne są zabezpieczonegrupy zabezpieczające typu kwasowego-labilnego Boc-Główną zaletą Fmoc jako grupy zabezpieczającej-aminę jest jejstabilność w warunkach kwaśnych; nie ma na to wpływu obróbka odczynnikami takimi jakkwas trifluorooctowy (TFA)i można je selektywnie usunąć za pomocąłagodna baza. Jednocześnie grupy zabezpieczające-łańcuch boczny, takie jak Boc, są trwałe w warunkach zasadowych i są usuwane w wyniku działania kwasem. Na koniec peptyd jest ilościowo odszczepiany od żywicy przy użyciuTFA/dichlorometan (DCM), unikając stosowania mocnych kwasów, a tym samym poprawiając bezpieczeństwo i zgodność z rutynową syntezą peptydów.
Historia rozwoju syntezy-peptydów w fazie stałej (SPPS)
1. Etap założycielski (początek XX w. do 1963 r.)
W1902, Emila Fischerajako pierwszy zbadał syntezę peptydów, ale postęp był powolny ze względu na ograniczenia techniczne. Zastosowano wczesne syntezygrupy zabezpieczające benzoil i acetyl, które były trudne do usunięcia i często do nich prowadziłyrozszczepienie łańcucha peptydowego.
W1932, Maksa Bergmannai współpracownicy-wprowadziligrupa benzyloksykarbonylowa (Z).jako -grupa zabezpieczająca grupę aminową. Tę grupę można usunąć w ramachuwodornienie katalityczne lub warunki kwasowe, zapewniając bardziej niezawodne narzędzie do syntezy peptydów i kładąc podwaliny pod rozwój syntezy peptydów w fazie stałej w latach sześćdziesiątych.
Podczas1950snaukowcom udało się zsyntetyzować różnorodnebiologicznie aktywne peptydy, takie jakoksytocyna i insulina. Osiągnięcia te przyczyniły się do dalszego rozwoju chemii peptydów i stworzyły podstawy do pojawienia się syntezy peptydów w fazie stałej.
2. Etap pionierski (1963)
W1963, Roberta B. Merrifieldazaproponowałmetoda syntezy peptydów w fazie stałej- (SPPS)., w którymC-aminokwas końcowyjest zakotwiczony do podłoża żywicznego, a łańcuch peptydowy jest wydłużany w powtarzanych cyklachodbezpieczanie i sprzęganie. Takie podejście znacznie uprościło proces syntezy peptydów i stało siępreferowana metodado składania peptydów.
Używany przez MerrifieldaBoc (tert-butyloksykarbonyl)aby chronić -grupę aminową. Pod koniec lat sześćdziesiątych opracował także tzwpierwszy w pełni zautomatyzowany syntezator peptydówi pomyślnie zsyntetyzowanebiałka biologicznejak na przykładrybonukleaza (124 aminokwasy). Za te przełomowe osiągnięcia Merrifield został nagrodzony Nagrodą imNagroda Nobla w dziedzinie chemii w 1984 r.
3.Etap Innowacji Technologicznych (1972)
W1972, Lou CarpinoopracowałGrupa zabezpieczająca 9-fluorenylometyloksykarbonyl (Fmoc)., co może byćdelikatnie usunąć w zasadowych warunkach, ograniczając reakcje uboczne. To sprawiło, że szczególnie nadaje się dozłożone peptydyIsynteza automatyczna.
TheMetoda Fmocstopniowo zastępowała metodę Boca jako strategię głównego nurtu. Zautomatyzowane syntezatory peptydów oparte na obuChemia Fmoc i Boczostały następnie opracowane, napędzającautomatyzacja syntezy peptydówi znacznie poprawia wydajność i powtarzalność.
4. Etap dojrzałości i ekspansji (od lat 90. do chwili obecnej)
Optymalizacja żywicy i odczynników:Rozwójwysoko obciążające, hydrofilowe-żywice modyfikowane PEGi skuteczne odczynniki sprzęgające, takie jakHBTUIHATUznacząco poprawił wydajność i wydajność syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS).
Integracja technologiczna:Nowe podejścia, npsynteza-wspomagana mikrofalamiIchemia przepływuskróciły czas reakcji i dodatkowo zwiększyły wydajność.
Podstawowe zasady i przebieg pracy SPPS:
Podstawową zasadą syntezy peptydów w fazie stałej-jeststopniowa konstrukcja łańcucha peptydowego na stałym podłożu, używającchroniąc strategie grupoweIreakcje kondensacji (sprzęgania).osiągnąćwydajne i kontrolowane składanie peptydów.
1. Rola stałego nośnika (żywicy) w syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS)
A nierozpuszczalna żywica polimerowa-takie jakpolistyren-diwinylobenzen usieciowany-żywica, żywica Wanga lub żywica amidowa Rink-jest wybierany jako solidne wsparcie w SPPS. Powierzchnia żywicy zawieragrupy funkcyjne(np. grupy hydroksylowe lub aminowe), które mogą się tworzyćwiązania kowalencyjne z jednym końcem łańcucha peptydowego, zazwyczajKoniec C.-, zakotwiczając peptyd do stałego podłoża. To kowalencyjne przyłączenie zapewnia wzrost peptydupozostaje związany z żywicą przez cały czas syntezy, co znacznieułatwia kolejne etapy reakcji, przemywanie i oczyszczanie
2.Ochrona strategii grupowej w syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS)
Podczas syntezy peptydów,-grupa aminowa, grupa karboksylowa i reaktywne grupy funkcyjne-łańcucha bocznegoaminokwasów (takich jak grupy tiolowe, karboksylowe i aminowe) są podatnereakcje uboczne. Aby zapobiec tym niepożądanym reakcjom,grupy zabezpieczającesą używane. Typowe grupy zabezpieczające obejmują:-Grupy zabezpieczające aminokwasy:
Boc (tert-butyloksykarbonyl):Kwas-nietrwały, łatwy do usunięciawarunki kwaśne.
Fmoc (9-fluorenylometyloksykarbonyl):Stabilny w warunkach kwaśnych, można go usunąćpodstawowe warunki(np. roztwór piperydyny/DMF).Boczne-Grupy zabezpieczające łańcuch:Wybrane zgodnie z właściwościami chemicznymi łańcucha bocznego aminokwasu. Powszechne grupy obejmująbenzylo (Bn), terc-butyl (tBu), trytyl (Trt)itp. Te grupy tousuwany pod koniec syntezy, zwykle podczas odszczepiania peptydu od żywicy przy użyciukwasem lub innymi specyficznymi warunkami.
3.C-Synteza końca do N-końca w SPPS
Wsynteza peptydów w-fazie stałej (SPPS), składanie peptydów zwykle rozpoczyna się wC-koniec (koniec karboksylowy)i postępuje stopniowo w kierunkuN-koniec (koniec aminowy). Dzieje się tak dlatego, żeAminokwas C-końcowy jest najpierw przyłączany do stałego podłoża, a kolejne aminokwasy są sprzęgane zwolna grupa aminowa łańcucha peptydowego już związana z żywicą, stopniowo wydłużając łańcuch peptydowy.
4. Reakcja sprzęgania w syntezie-peptydów w fazie stałej (SPPS)
Aminokwasy chronione muszą byćaktywowanyaby ichgrupy karboksylowe stają się reaktywne, umożliwiając im utworzeniewiązanie peptydowez grupą aminową peptydu-związanego z żywicą. Wspólnyodczynniki aktywującewłączaćkarbodiimidy(np. DCC, DIC),HOBt, HATU, IPyBOP. Po aktywacji grupa karboksylowa reaguje z wolną grupą aminową w areakcja kondensacji, tworzącwiązanie amidowei w ten sposób przyłączając nowy aminokwas do rosnącego łańcucha peptydowego.
5. Powtarzalne (cykliczne) operacje w syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS)
Proces obejmujepowtarzanie cyklu odbezpieczania → sprzęgania → przemywania, dodawaniejeden aminokwas na cyklstopniowe wydłużanie łańcucha peptydowego. Po każdymreakcja sprzęgania, żywica jestumyty(np. z rozpuszczalnikami takimi jak DMF lub DCM) w celu usunięcia nieprzereagowanych odczynników,-produktów ubocznych i nadmiaru aminokwasów. TheNastępnie grupę aminową nowo dodanej reszty odbezpiecza się -, odsłaniając wolną aminę w celu przygotowania do następnej reakcji sprzęgania. Cykl ten powtarza się aż do całkowitego złożenia pożądanej sekwencji peptydowej.
6. Rozszczepienie w syntezie-peptydów w fazie stałej (SPPS)
Gdy łańcuch peptydowy osiągnie pożądaną długość, tak jestoddzielone od stałego podłożaprzy użyciu odpowiedniego odczynnika, jednocześnieusunięcie wszystkich grup zabezpieczających. Powszechnie stosowanym odczynnikiem rozszczepiającym jestkwas trifluorooctowy (TFA), które nie tylkorozrywa wiązanie pomiędzy peptydem a żywicąale takżeusuwa grupy zabezpieczającetakie jak Fmoc i Boc, przywracając peptydowi jego postaćstan rodzimy. Gdy łańcuch peptydowy osiągnie pożądaną długość, tak jestoddzielone od stałego podłożaprzy użyciu odpowiedniego odczynnika, jednocześnieusunięcie wszystkich grup zabezpieczających. Powszechnie stosowanym odczynnikiem rozszczepiającym jestkwas trifluorooctowy (TFA), które nie tylkorozrywa wiązanie pomiędzy peptydem a żywicąale takżeusuwa grupy zabezpieczającetakie jak Fmoc i Boc, przywracając peptydowi jego postaćstan rodzimy.
Poprzez te kroki,synteza peptydów w-fazie stałej (SPPS)umożliwiawydajne i kontrolowane składanie łańcuchów peptydowych na stałym podłożu, unikając skomplikowanych pośrednich etapów oczyszczania wymaganych w tradycyjnej syntezie-fazy roztworu i znaczniepoprawa wydajności i wydajności syntezy.
Poprzez te kroki,synteza peptydów w-fazie stałej (SPPS)umożliwiawydajne i kontrolowane składanie łańcuchów peptydowych na stałym podłożu, unikając skomplikowanych pośrednich etapów oczyszczania wymaganych w tradycyjnej syntezie-fazy roztworu i znaczniepoprawa wydajności i wydajności syntezy.
