Technologia membranowa i wyjaśnienie szczepionek (I)
Szczepionki pochodzą z różnych źródeł, w tym z ekstraktów tkankowych, komórek bakteryjnych, cząsteczek wirusowych, białek i kwasów nukleinowych wytwarzanych przez rekombinowane komórki ssaków, drożdży i komórek owadów.
Najpopularniejsza metoda produkcji szczepionek opiera się na początkowym procesie fermentacji, po którym następuje oczyszczanie. Produkcja szczepionek to złożony proces, który obejmuje wiele różnych etapów i procesów. Wybór właściwej metody oczyszczania ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanej czystości produktu końcowego. Klarowanie szczepionek to ważny etap, który ma znaczący wpływ na odzyskiwanie produktu i późniejsze oczyszczanie w dół. Do klarowania szczepionek można zastosować kilka technik. Wybór metody zbierania i sprzętu zależy od rodzaju baterii, charakteru zbieranego produktu i cieczy procesowej. Techniki te obejmują filtrację membranową (mikrofiltrację, filtrację przepływową styczną), wirowanie i głęboką filtrację (filtrację przepływową normalną). Z wieloletniego doświadczenia wynika, że klarowanie zbioru szczepionek jest zwykle osiągane przez wirowanie, po którym następuje głęboka filtracja.
W ostatnich latach techniki oparte na membranach zyskały na znaczeniu w klarowaniu szczepionek. Procesy upstream coraz częściej wykorzystują technologie jednorazowego użytku, więc strategie zbiorów muszą się zmienić. Niniejszy artykuł zawiera kompleksowy przegląd różnych technologii opartych na membranach i ich zastosowań w klarowaniu szczepionek.
01 Wprowadzenie
Szczepionki są krytycznym elementem naszej profilaktyki chorób zakaźnych, które pozostają szokującą przyczyną śmierci. Od 2 do 3 milionów ludzi jest co roku ratowanych przed błonicą, tężcem, krztuścem i odrą dzięki szczepieniom. Szczepionki obejmują szeroki zakres, od małych białek rekombinowanych po całe cząsteczki wirusa i całe bakterie. Mogą być produkowane przez różne systemy: jaja, komórki ssaków, bakterie itp. Ze względu na złożoność i różnorodność szczepionek nie ma obecnie głównego protokołu oczyszczania ani szablonu, pomimo rosnącego zainteresowania platformami szczepionkowymi.
Zazwyczaj proces produkcji szczepionki można podzielić na trzy części: upstream (produkcja i klarowanie), downstream treatment (oczyszczanie, w tym ultrafiltracja, chromatografia i obróbka chemiczna) i formulacja (operacje końcowego napełniania). Niezależnie od systemu produkcyjnego, klarowanie (wstępne usuwanie niepożądanych substancji) odgrywa kluczową rolę w określaniu solidnego procesu oczyszczania. Prawidłowy etap klarowania usuwa głównie całe komórki, szczątki komórek, koloidy i duże agregaty, aby zmniejszyć obciążenie przetwarzania downstream. W niektórych przypadkach klarowanie może również zmniejszyć nierozpuszczalne zanieczyszczenia, białka komórek gospodarza (HCP) i kwasy nukleinowe komórek gospodarza. Podobnie jak każdy inny etap oczyszczania, etap klarowania musi zostać zoptymalizowany w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności i czystości produktu przy jednoczesnym dostosowaniu do specyfiki i ograniczeń produkcyjnych szczepionki.
Ze względu na niejednorodność typów szczepionek do ich klarowania stosuje się różne techniki, w tym wirowanie i filtrację (Tabela 1).
Zwykle wymagane jest wykonanie kilku serii operacji, aby osiągnąć pożądane klarowanie. Pierwsza operacja ma na celu usunięcie większych cząstek (klarowanie pierwotne), a druga operacja ma na celu usunięcie koloidów i innych cząstek submikronowych (klarowanie wtórne). Wirowanie przy niskiej prędkości służy jako jednorazowa opcja klarowania, umożliwiając usunięcie komórek i resztek komórek przez wytrącanie. Wirowanie może obsługiwać duże ładunki stałe i jest szeroko stosowane w trybie wsadowym lub ciągłym oraz w wirówkach tarczowych. Wymaga wysokich nakładów inwestycyjnych i kosztów utrzymania oraz napotyka wyzwania w zakresie skalowania w górę z powodu braku niezawodnego modelu skalowania w dół. Jednak niektórzy komercyjni producenci szczepionek używają wirówek w produkcji na dużą skalę, obejmującej duże wolumeny przetwarzania i więcej działań produkcyjnych.
Filtrację klarującą można przeprowadzić za pomocą filtracji przepływowej normalnej (NFF, znanej również jako filtracja bezpowrotna) lub filtracji przepływowej stycznej (TFF, znanej również jako filtracja przepływowa krzyżowa). Istnieją również określone tryby filtrowania (filtry głębokie), które zawierają materiały naładowane dodatnio i AIDS filtracyjne, które zwiększają retencję resztek komórek, koloidów i niepożądanych składników naładowanych ujemnie.
Filtry membranowe zatrzymują cząstki poprzez wykluczenie wielkości i nie mają dużej pojemności zatrzymywania brudu, dlatego nadają się do etapów wtórnego klarowania. Zarówno głębokie filtry, jak i filtry membranowe są łatwe do skalowania i wdrożenia (prosta konstrukcja systemu). W przeciwieństwie do NFF, TFF jest stosowany głównie do pierwotnego klarowania (mikrofiltracja). Membrany o zakresie odcięcia 0.1-0.65 μm (najlepiej z otwartym kanałem) były z powodzeniem stosowane do zatrzymywania komórek, resztek komórek i innych dużych zanieczyszczeń. Większość urządzeń TFF jest liniowo skalowalna i nadaje się do ponownego użycia po czyszczeniu, co znacznie obniża koszt materiałów eksploatacyjnych na tym etapie.
Etap klarowania jest etapem pośrednim pomiędzy procesami wstępnymi i końcowymi i czasami jest pomijany w procesie opracowywania szczepionek, ponieważ czas i zasoby są priorytetowo traktowane w przypadku innych etapów oczyszczania, takich jak chromatografia lub wirowanie w gradiencie gęstości.
Nawet patenty na procesy produkcji szczepionek często pomijają etap klarowania. Wydajność klarowania bezpośrednio wpływa na wydajność dalszego procesu. Źle zoptymalizowany etap klarowania może negatywnie wpłynąć na wydajność sterylizowanego filtra lub skrócić żywotność żywicy chromatograficznej. Obecnie bardziej rygorystyczne oczekiwania regulacyjne sprawiają, że producenci szczepionek produkują czystsze, dobrze scharakteryzowane, ale niedrogie szczepionki. W takim przypadku każdemu etapowi należy poświęcić uwagę, na jaką zasługuje. Obecne trendy sugerują, że proces poprzedzający zmierza w kierunku „czystszego” systemu ekspresji (tj. komórki hodowane w mediach bez surowicy zastępują jaja) o zwiększonej produktywności i wyższej gęstości komórek.
Procesy oczyszczania downstream są upraszczane i usprawniane w celu zwiększenia czystości produktu końcowego. Aby poradzić sobie z tymi zmianami, etap klarowania nie może stać się wąskim gardłem. W tym przypadku technologia filtracji stawia czoła nowemu wyzwaniu klarowania, zajmując się kwestiami zwiększonej elastyczności procesu, możliwości jednorazowego użycia i obniżonych kosztów inwestycyjnych.
02 Wyjaśnienie szczepionek wirusowych
Do klarowania zbiorów w paszy dla szczepionek z powodzeniem zastosowano kilka rodzajów metod klarowania, stosowanych samodzielnie lub w połączeniu.
Skala pilotażowa: 1-20L, skala produkcyjna: ponad 20L
2.1 Środki ostrożności dotyczące wyjaśnienia szczepionki przeciwwirusowej
Wiele szczepionek zawiera wszystkie lub część cząsteczek wirusa, aby wytworzyć odporność na infekcję wirusową. Generalnie dzielą się na cztery szerokie kategorie:
Żywa atenuowana szczepionka (LAV), która opiera się na osłabionym szczepie wirusa, aby zmniejszyć jego wirulencję. Atenuowane wirusy mogą replikować się w organizmie, ale nie są patogenne.
- Szczepionki z inaktywowanym wirusem (IV), które zawierają chemicznie lub ultrafioletowo inaktywowane wirusy w celu wyeliminowania zakaźności. Cząsteczki wirusa mogą być kompletne, podzielone lub oczyszczone (tylko białka antygenowe).
- Szczepionka wektorowa wirusowa (VV) jest aktywnym, niepatogennym wirusem, który prezentuje antygen patogennego wirusa. Te niedawno opracowane struktury są również wykorzystywane w zastosowaniach terapii genowej.
Szczepionki zawierające cząsteczki wirusopodobne (VLP) to szczególna klasa szczepionek podjednostkowych wirusów, które naśladują ogólną strukturę cząsteczek wirusowych, ale nie zawierają zakaźnego materiału genetycznego.
W większości przypadków cząsteczki wirusa pozostają nienaruszone podczas etapu klarowania, nawet podczas lizy szczepionki wirusowej (rozszczepienie zwykle odbywa się później, w bardziej oczyszczonym środowisku).
Głównym wyzwaniem w klarowaniu wirusów jest odzyskiwanie cząstek wirusowych o wysokiej wydajności przy jednoczesnym skutecznym usuwaniu resztek komórek, dużych agregatów i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Jak opisano w poniższych sekcjach, istnieje kilka czynników, które mogą powodować degradację lub utratę wirusa. Ponadto trudno polegać na wydajności wirusa ze względu na dużą zmienność metod ilościowego badania wirusów na tym etapie procesu, szczególnie w przypadku szczepionek LAV i VV. W przypadku tych szczepionek wydajność wirusa jest często oceniana przy użyciu testów zakaźności, takich jak test płytkowy lub test TCID 50. Fakt, że niektóre zebrane związki mogą zakłócać zdolność wirusa do zakażania komórek wskazujących, zwiększa zmienność tego podejścia ilościowego.
2.2 Strategia wyjaśniania szczepionki przeciwwirusowej
Szczepionki wirusowe różnią się znacznie pod względem wielkości, struktury, kształtu i systemów ekspresji (Tabela 3).
W rezultacie nie ma ogólnie żadnego szablonu dla procesów downstream, zwłaszcza etapów klarowania. Teoretycznie wszystkie dostępne techniki (wirowanie wolnoobrotowe, mikrofiltracja TFF, NFF) można wybrać i potencjalnie połączyć, aby klarować wirusa. W rzeczywistości na sukces metod klarowania wpływa system ekspresji i właściwości fizykochemiczne zaangażowanych wirusów.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>Metoda klarowania {{0}} komórek /ml) z wykorzystaniem polimerów kationowych zmniejszyła obszar głębokiej filtracji czterokrotnie w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Technika ta umożliwia zbiór fermentatorów o dużej pojemności bez użycia wirówek. Podobnie Riske i in. wykazali, że obróbka chitozanem 40-litrowych kultur komórkowych (0,02%) zawierających 1,4-2,6% substancji stałych doprowadziła do 7-krotnego wzrostu bezwzględnej pojemności filtra po głębokiej filtracji.
Wspominają również, że chitozan wydaje się poprawiać wydajność klarowania poprzez flokulację cząstek submikronowych, które zazwyczaj osadzają się w wirówkach. Metody wstępnego przetwarzania i flokulacji prawdopodobnie nadal będą częścią przyszłych klarowań filtracji szczepionek. Penetranty, w tym cukry, glikole i aminokwasy, preferencyjnie flokulują wirusy. Flokulacja wirusów z roztworem osmotycznym, a następnie mikrofiltracja 0.2µ może być stosowana jako kompleksowy proces oczyszczania wirusów. Penetranty mogą stymulować agregację wirusów poprzez redukcję warstwy hydratacyjnej wokół cząstek w celu flokulacji hydrofobowych nieotoczonych cząstek wirusa i otoczonych nimi cząstek wirusa. Chociaż wykazano, że penetranty flokulują wirusy, metoda ta ma potencjał, aby stać się platformą do przyszłego oczyszczania szczepionek, a jej wykonalność w pilotażowym lub wielkoskalowym oczyszczaniu szczepionek nie została udowodniona. Metoda wstępnego oczyszczania flokulacyjnego, która prawdopodobnie będzie nadal częścią przyszłego klarowania filtrów szczepionkowych, jest wykonywana w fermentorze 2L. Aby potencjalnie można było je stosować w operacjach produkcyjnych na dużą skalę, metody te muszą zostać zweryfikowane w skali pilotażowej i produkcyjnej.
2.2.1 Wyrażanie wpływu systemu
Metoda klarowania zależy głównie od rodzaju procesu wstępnego i systemu ekspresji, który określa rodzaj i poziom zanieczyszczeń, które mają zostać usunięte. Szczepionki wirusowe są zwykle produkowane w zarodkach kurzych przez ciągłe linie komórkowe ssaków lub ptaków lub komórki bakulowirusa/owadzich, które są bardziej złożonym systemem ekspresji. Niektóre typy VLP mogą być również produkowane przez inne heterologiczne systemy ekspresji (bakterie, drożdże, komórki roślinne).
2.2.1.1 Wirus wytwarzany w zarodku kurzym
Szczepionki są produkowane w jajach od dziesięcioleci. Prace te sięgają 1931 r., kiedy Woodruff i Good Pasture z powodzeniem wykorzystali błonę kosmówkowo-omoczniową zapłodnionych jaj jako podłoże do wzrostu wirusa. Obecnie wiele szczepionek dla ludzi i zwierząt jest nadal produkowanych przy użyciu tego starożytnego procesu. Najbardziej znana jest prawdopodobnie szczepionka przeciwko grypie sezonowej. Zasada polega na zaszczepieniu jaj kurzych wirusami będącymi przedmiotem zainteresowania, a następnie replikacji w błonie kosmówkowo-omoczniowej. Po reprodukcji zbiera się i oczyszcza płyn omoczniowy bogaty w cząsteczki wirusa.
Płyn omoczniowy jest trudnym do oczyszczenia pokarmem. Wysoka zawartość minerałów i białka (w tym owalbuminy) zapewnia mu wysoką lepkość. Płyn omoczniowy zawiera również niezbędne związki tkankowe z zarodków kurzych, takie jak pióra, dzioby, naczynia krwionośne lub komórki krwi. Ze względu na wysoką zawartość ciał stałych, wirowanie przy niskiej prędkości jest preferowaną opcją do pierwotnego klarowania, co zwykle skutkuje wskaźnikiem odzysku wynoszącym około 70%. Jednak pierwotne klarowanie przy użyciu technik filtracji jest również możliwe. W przypadku NFF, głębokie filtry na bazie polipropylenu i celulozy mają dobre możliwości zbierania płynu omoczniowego. Filtry powierzchniowe wykonane z głębokich filtrów na bazie polipropylenu lub celulozy mogą mieć pojemność 150-210 L/m² i zmniejszać mętność przepływu pokarmu nawet 3-krotnie. Urządzenie TFF z otwartym kanałem zasilającym nadaje się również do klarowania płynu omoczniowego, ponieważ urządzenie jest bardziej odpowiednie do minimalnej utraty ciśnienia przez kanał zasilający, zmniejszając w ten sposób blokowanie kanału.
Wtórny etap klarowania można łatwo wykonać za pomocą NFF. Połączenie materiałów polipropylenowych, celulozowych i włókien szklanych wykazuje zazwyczaj dobrą wydajność, a alternatywą dla wtórnego etapu klarowania jest użycie TFF i urządzenia z membraną mikrofiltracyjną {{0}}.65μm lub 0,45μm i obsługa sterowania przepływem osmotycznym. W tym etapie można użyć urządzenia TFF z otwartym kanałem z hydrofilową membraną PVDF lub hydrofilową membraną PES.
Ważne jest, aby zauważyć, że cząstki wirusa mogą być związane z nierozpuszczalnym materiałem resztkowym, co może znacznie zmniejszyć produkcję wirusa podczas klarowania. Użycie roztworu soli może zmniejszyć to powiązanie między wirusami grypy a stałymi fragmentami, co skutkuje mniej więcej dwukrotnym wzrostem produkcji bez wpływu na integralność cząstek wirusa.
2.2.1.2 Wirusy wytwarzane w kolejnych liniach komórkowych ssaków i ptaków
Ostatnio niektóre szczepionki wirusowe odeszły od procesów opartych na jajach na rzecz procesów opartych na hodowlach komórkowych (szczególnie w przypadku szczepionek przeciw grypie). Głównym powodem tej zmiany jest zapobieganie problemom z produkcją szczepionek związanym z jajami zarodkowymi (tj. niedoborowi dostaw jaj, który może wystąpić w przypadku wybuchu jakiejkolwiek choroby drobiu). W rezultacie wiele rodzajów szczepionek i wektorów wirusowych jest obecnie opracowywanych przy użyciu ciągłych linii komórkowych ssaków lub ptaków, konwencjonalnych linii komórkowych (takich jak linie komórkowe Vero, MDCK lub HEK293) lub zastrzeżonych linii komórkowych.
W zależności od systemu ekspresji wirus może pozostać wewnątrz komórki, wymagając etapu lizy komórki, lub może pozostać na zewnątrz komórki (liza lub pączkowanie). Stały ładunek i rozpuszczalna zawartość uzyskane z hodowli komórkowej są znacznie czystsze niż faza płynna omoczni. W rezultacie technologia NFF jest łatwiejsza do wdrożenia, a wydajność jest znacznie wyższa. Jednak wydajność filtracji jest w dużym stopniu zależna od warunków hodowli komórkowej, takich jak gęstość komórek lub żywotność komórek w momencie zbioru. Parametry te wpływają na ilość resztek komórek i makroagregatów, które mogą zatykać głębokie filtry i membrany, co skutkuje zmniejszoną wydajnością.
Thomassen i in. podają dobry przykład klarowania NFF. Stosowane w procesie produkcji inaktywowanego wirusa polio (IPV). Komórki Vero hodowane na mikronośnikach były używane do proliferacji wirusa z gęstością komórek {{0}}.78 x 106 komórek/ml TOI. Do wstępnego klarowania w celu usunięcia mikronośników ze zbioru używa się sita ze stali nierdzewnej o średnicy oczek 75 μm. Dwuwarstwowa gradacja jest klarowana przy użyciu filtra o dużej gęstości (0.2-2.0 μm), a następnie sterylizowanego filtra gradacyjnego.
Wybrana skalowalna jednostka jednorazowego użytku została pomyślnie użyta do przygotowania materiału do badań klinicznych Sabin IPV w skali 350 L. W zależności od serotypu wirusa uzyskano wskaźnik odzysku wirusa od 86 do 96 procent.
2.2.1.3 Bakulowirusy/cząsteczki wirusopodobne wytwarzane w układzie komórek owadów
Rozważanie systemów bakulowirusów/komórek owadzich do produkcji szczepionek na dużą skalę jest stosunkowo nowe, ale wzbudza coraz większe zainteresowanie w dziedzinie wektorów wirusowych i VLP. Główną zaletą tego systemu jest to, że wiąże się z krótkotrwałą (nie ma potrzeby tworzenia linii komórkowych) i bezpieczną (brak kompletnego DNA wirusowego) produkcją. Istnieją również pewne wady, takie jak konieczność usuwania bakulowirusów i stabilność produktu.
Cervarix, szczepionka VLP przeciwko zakażeniom wirusem brodawczaka ludzkiego produkowana przez GlaxoSmithKline, jest pierwszą ludzką szczepionką komercyjnie produkowaną w komórkach owadów. Obecnie opracowywanych jest wiele szczepionek opartych na VLP i wektorach rAAV produkowanych w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem. Linie komórek owadów pochodzące z mszycy jesiennej Spodoptera frugiperda (Sf9 i Sf21) i zginacza kapustnika Trichoplusia ni (komórki BTI-TN5B1-4) są najczęściej stosowane ze względu na ich zdolność do wzrostu w zawiesinie, co upraszcza amplifikację procesu wstępnego. Po osiągnięciu pożądanej gęstości żywych komórek komórki te są infekowane rekombinowanym bakulowirusem w fazie wykładniczego wzrostu komórek w celu ekspresji białka. Duży genom bakulowirusów umożliwia ekspresję pięciu lub więcej różnych białek, co odpowiada złożoności VLP i wektorów wirusowych.
Bernard i in. opisali dalszy proces hodowli komórek owadów. Proces ten jest bardzo zmienny, odzwierciedlając różnorodność białek wytwarzanych tą techniką. Pierwszy etap sekwencji oczyszczania jest silnie uzależniony od charakterystyki objętości bioreaktora (tj. gęstości i żywotności komórek) lub od charakteru uwalnianego produktu (wydzielanego przez pączkowanie lub lizę komórek). Zakażenie komórek owadów bakulowirusem może spowodować lizę komórek w ciągu 3-5 dni. Zniszczenie komórek może prowadzić do wzrostu aktywności proteolitycznej i innych czynników środowiskowych, które mogą prowadzić do degradacji białek rekombinowanych.
Podejmowano próby opracowania bakulowirusów o mniejszej zdolności inicjowania lizy komórek. Bakulowirus lizy mniej niż 10 procent zainfekowanych owadów.
Lizę komórek można przeprowadzić różnymi metodami, takimi jak zamrażanie-rozmrażanie, detergenty, homogenizatory lub obróbka ultradźwiękowa. Komórki owadów nie mają ściany komórkowej i dlatego szybko się rozpuszczają. Chociaż obróbka ultradźwiękowa została zgłoszona w wielu procesach laboratoryjnych, jest ona rzadko stosowana na skalę eksperymentalną lub komercyjną. Najpopularniejszą metodą jest użycie homogenizatora do zniszczenia komórek w obecności detergentu o niskim stężeniu (0.1% Triton X-100 lub NP-40). Zastosowanie detergentów i mikrofluidyzacji lub homogenizacji osmotycznej zostało z powodzeniem zastosowane w wielu procesach produkcyjnych na dużą skalę. Zazwyczaj komórki owadów są zawieszane w buforach lizy (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,2 mM PMSF i inhibitory proteazy), podczas których dodawany jest Triton-X100 do końcowego stężenia 0,1%, a następnie przeprowadzana jest łagodna obróbka ultradźwiękowa lub mikrofluidyzacja. Następnie mieszanina jest wirowana w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek.
Na tym etapie lizat może wydawać się bardzo mętny i trudno go filtrować za pomocą filtra 0.45μm. Czasami można zaobserwować straty do 30% podczas etapu klarowania pirolizy. Dodanie benzoenzymów na etapie rozszczepiania pomaga rozwiązać problem filtracji. Czyszczenie komórek buforowaną fosforanem solanką po zbiorze i szybkie „zamrażanie-rozmrażanie” w roztworze o wysokiej zawartości soli (500 mM NaCl) zawierającym bufor krakingowy pomaga usunąć agregaty.
Klarowanie VLP i wektorów wirusowych wytwarzanych przez komórki owadów następuje po lizie komórek (przez obróbkę chemiczną lub mechaniczną), która uwalnia nie tylko cząsteczki wirusowe, ale także duże ilości kwasu nukleinowego komórkowego. Komórki owadów są w stanie rosnąć przy dużej gęstości komórek, od 1-9.10 6 komórek/ml. Dlatego etap klarowania powinien obejmować dużą gęstość komórek, wysoką zawartość kwasu nukleinowego i, jeśli to możliwe, usuwanie cząstek bakulowirusa. Aby jeszcze bardziej skomplikować sprawę, VLP lub wektory wirusowe i bakulowirusy mogą mieć podobne rozmiary (bakulowirusy mają 60-80 nanometrów szerokości i 300-400 nanometrów długości). Ze względu na dużą gęstość komórek wirowanie jest od dziesięcioleci preferowaną techniką pierwotnego klarowania. Jednak procesy membranowe wydają się być bardzo atrakcyjną alternatywą, ponieważ skalowalność jest łatwa do zdefiniowania.
Głębokie filtry były skutecznie stosowane w dalszym procesie trójwarstwowych rotawirusopodobnych cząstek. Na poziomie laboratoryjnym, metoda ultracentrifugacji gradientu gęstości CsCl jest często stosowana do oczyszczania tych złożonych cząstek. Naukowcy ocenili nie tylko etap klarowania głębokiego filtra, ale także cały dalszy proces (rozszczepienie Triton X-100 i głęboka filtracja, a następnie ultrafiltracja i wykluczenie wielkości cząstek). Wyniki pokazują, że wydajność gradientu gęstości CsCl może osiągnąć 37%.
Metoda ultracentrifugalna to około 10%. Jako inny przykład, 0,45μm włókna puste i 500 kDa włókna o małej średnicy zostały użyte do odzyskania i skoncentrowania cząstek podobnych do HIV wytwarzanych w komórkach owadów. W tym badaniu siła ścinająca włókien pustych została zoptymalizowana na podstawie integralności komórki. Wyniki Opracowano proces o niskiej sile ścinającej, aby zastąpić ultracentrifugację gradientową cukru stołowego.
Proces ten ma potencjał do zastosowania w produkcji masowej. Głębokie filtry zostały również z powodzeniem użyte w produkcji rekombinowanych wirusów adenozależnych. Lizę komórek wykonano przy użyciu dwutłokowego mechanicznego blokera komórek, a następnie zastosowano obróbkę nukleazą. W etapie klarowania zastosowano element głębokiego filtra z włókna szklanego o grubości 1,2 μm, a następnie dwie warstwy hydrofilowego PES 0.8 μm i hydrofilowego PES 0.2 μm. Filtry o proporcjonalnych rozmiarach są używane do partii procesowych od mniejszych do rozmiarów 200 L. Głębokie filtry zostały z powodzeniem użyte, a oceny TFF z płaskimi filmami lub włóknami pustymi o grubości 0,2 µm lub 0,45 µm również okazały się bardzo skuteczne.
Badanie przeprowadzone przez Tecnologica (IBET) w Instytucie Biologii Eksperymentalnej Oeiras w Portugalii wykorzystało NFF do przeprowadzenia klarowania VLP wirusa zapalenia wątroby typu C wyrażonego przez bakulowirusy bez wirowania. Filtry polipropylenowe o nominalnej wartości znamionowej (10,5,0.6 i 0.3μm) są używane do klarowania zbiorów VLP. Te same filtry o wartościach porów 0.6μm i 0,3μm są używane do filtracji w centrach zbierania VLP. Wszystkie badane filtraty zostały przetestowane pod kątem wskaźników odzysku VLP HCV i porównano zalecane metody filtracji. Wyniki przedstawiono w Tabeli 4.
Wyniki wykazały, że filtr 5μm-0.3μm miał najwyższy odzysk produktu (100%) dla bezpośrednio zebranego paszy VLP wirusa zapalenia wątroby typu C. Filtr polipropylenowy 0,6μm miał najwyższy odzysk produktu (82%) dla paszy centralnej, a klirens DNA komórki gospodarza wynosił około 70%.
2.2.1.4 Cząsteczki wirusopodobne wytwarzane w systemach bakteryjnych lub drożdżowych
Rodzaj metody klarowania szczepionek VLP ekspresowanych w systemach bakteryjnych lub drożdżowych zależy od uwalniania VLP do mediatorów pozakomórkowych. Jeśli VLP nie mogą być wydajnie wydzielane, liza komórek lub inne etapy ekstrakcji mogą być wymagane przed faktycznym etapem klarowania. Podczas gdy jest to złoty standard w branży klarowania białek, wirowanie (ciągłe lub wsadowe) ekspresowane w systemach bakteryjnych lub drożdżowych, ostatnio procesy membranowe stały się bardzo atrakcyjną alternatywą ze względu na łatwość skalowalności i kompatybilność z zabiegami jednorazowego użytku.
Richter i Topell wyjaśniają zastosowanie wirowania, TFF lub kombinacji obu metod podczas przygotowywania VLP produkowanych w klarowanych E. coli. W ich pracy membrany 0.45m TFF zostały użyte do rozcieńczenia i klarowania homogenizowanych homogenatów E. coli w temperaturze 5 stopni. Zauważają również, że TFF na bazie membrany nadaje się do obsługi zbiorów o wysokiej lepkości, najlepiej przy użyciu jednostek TFF z konfiguracjami kanałów otwartych.
Klarowanie odśrodkowe zostało również ocenione jako alternatywa dla TFF. W tym przypadku otrzymany homogenat nie został rozcieńczony i odwirowano w temperaturze 4 stopni przez 105 minut, 10000g. Bez przenoszenia miękkiej powłoki, supernatant wylano z cząstek i ponownie odwirowano w temperaturze 4 stopni i 10 000 g przez 60 min. Następnie supernatant usunięto z obecnych cząstek, rozcieńczono buforem EB (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 i przefiltrowano przez sterylne urządzenie filtrujące 0,22 m. Dalsze przetwarzanie. Proces zwiększania skali produkcji tej szczepionki VLP w E. coli w skali 800L został podobno wyjaśniony poprzez połączenie wirowania i TFF.
Rekombinowana szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu E HEV 239 została dopuszczona w Chinach do immunizacji osób dorosłych w wieku 16 lat i starszych. Antygeny szczepionkowe (VLP) są wyrażane w E. coli, a wykazano, że skalowanie procesu produkcji antygenu odbywa się w skali 50L. Produkt został wyekstrahowany przez rozbicie E. coli, a ciała inkluzyjne oddzielono od fragmentów komórek przez intensywne płukanie buforem zawierającym 2% Triton X-100, a następnie rozpuszczono w homogenizatorze mocznika 4 M. TFF klaruje VLP wirusa brodawczaka ludzkiego wytwarzane w Saccharomyces cerevisiae (15L). Lizat komórkowy traktowany nukleazą został klarowany przez mikrofiltrację przepływową krzyżową w trybie transfiltracji przy użyciu filtra z pustymi włóknami o średnicy porów 0,65 μm. Ten sam proces jest stosowany w produkcji szczepionek. Mimo że tylko kilka szczepionek na bazie VLP osiągnęło skalę komercyjną, trwają prace nad kilkoma innymi, a większość z nich jest klarowana przy użyciu wirowania lub technologii membranowej.
Ograniczeni wpływem przestrzeni, podzielimy się drugą połową treści w następnym rozdziale. W następnym artykule podzielimy się kilkoma przypadkami wyjaśnienia szczepionki i wykorzystania odpowiednich składników błonowych.
Jako pierwsza firma w obwodzie lokalizacji, Guidling Technology zgromadziła wystarczające doświadczenie w zakresie klarowania szczepionek. Guidling Technology to firma zajmująca się rozwojem i produkcją, skupiająca się na biofarmaceutyce i hodowli komórkowej, oczyszczaniu i separacji. Produkty są szeroko stosowane w biomedycynie, diagnostyce, filtracji płynów przemysłowych, wykrywaniu, klarowaniu, oczyszczaniu i procesach koncentracji; Guidling pomyślnie opracował probówkę wirówki ultrafiltracyjnej, kasetę membranową ultrafiltracji/mikrofiltracji, filtr do usuwania wirusów, urządzenie filtrujące o przepływie stycznym, głęboki stos membran itp., które w pełni spełniają scenariusze zastosowań biofarmaceutyki i hodowli komórkowej.
Nasze membrany i filtry membranowe są szeroko stosowane w koncentracji, ekstrakcji i separacji wstępnej filtracji, mikrofiltracji, ultrafiltracji i nanofiltracji. Nasza szeroka gama linii produktów, od małych jednorazowych laboratoryjnych systemów filtracyjnych po systemy filtracji typu produkcyjnego, testy sterylności, fermentację, hodowlę komórkową i wiele innych, może sprostać potrzebom testowania i produkcji.
