Literatura Udostępnij|Pożegnaj się z złożonym oczyszczeniem? Nowatorska metoda surfaktantów TFF + poprawia wydajność i zmniejsza koszty w produkcji wektora AAV

Terapia genowa szybko się rozwija, ale jej wysoki koszt pozostaje główną barierą zapobiegającą szerszego dostępu pacjentów. Wśród kluczowych czynników tego kosztu jest złożony proces produkcji wektorów adeno -. Badanie opublikowane w biotechnologii i bioinżynierii opracowało nową metodę oczyszczania łączącą styczną filtrację przepływu (TFF) z środkami powierzchniowo czynnymi, która obiecuje uprościć proces oczyszczania AAV i zmniejszyć koszty. Zagłębiajmy się w te badania prowadzone przez zespół z University of Tokyo.

 

1. Tło badania: Wyzwania i obecny status oczyszczania AAV

Wektory AAV stały się „gwiazdą” narzędziami dostarczania w terapii genowej ze względu na ich wysokie bezpieczeństwo, niską immunogenność, zdolność do infekowania zarówno podziału, jak i nie- i pojemności na długi - ekspresja genu. Jednak ich proces produkcyjny jest złożony, szczególnie dalsze etapy oczyszczania, które zwykle obejmują wiele rund wirowania i chromatografii. Te metody to czas - konsumpcja, praca - intensywna, trudna do skalowania i kosztowna.

W skali laboratoryjnej oczyszczanie często opiera się na ultracentryfugacji gęstości gęstości jodiksanolu, co jest trudne do skalowania produkcji przemysłowej. Chromatografia powinowactwa jest coraz częściej stosowana, ale wymagane warunki o niskim pH mogą zaburzyć zakaźność wirusową. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie prostej, wydajnej, delikatnej i skalowalnej metody oczyszczania AAV.

Filtracja przepływu stycznego (TFF) jest techniką separacyjną opartą na rozmiarze - powszechnie stosowanej do koncentracji i bufora - wymiany bioproduktów. Jednak konwencjonalna TFF ma ograniczoną zdolność do usuwania zanieczyszczeń, takich jak białka komórek gospodarza (HCPS) i DNA podczas oczyszczania AAV, często pozostawiając za sobą agregaty białkowe.

 

2. Innowacyjne podejście: TFF w połączeniu z środkami powierzchniowo czynnymi w celu skutecznego oczyszczania

Aby przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnego TFF, naukowcy Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa i współpracownicy z University of Tokyo opracowali sprytną strategię: stosowanie środków powierzchniowo czynnych w celu hamowania agregacji i interakcji białek zanieczyszczania wirusowych (~ 25. pod względem wielkości).

Testowali trzy rodzaje środków powierzchniowo czynnych:

• Non - ionic:Glukozyd Octyl
• Anionowy:Deoksycholan sodu
• Ztedterionic:CHAPS

Badanie wykazało, że użycie samego środka powierzchniowo czynnego nie - było nieskuteczne. Zarówno anionowy deoksycholan sodu, jak i ztolioniowe CHAP znacznie zwiększają usuwanie resztkowych białek i celowały w różne populacje białka. Ostatecznie łączenie 0,5% deoksycholanu sodu z 1% CHAPS przyniosło niezwykłe wyniki, prawie całkowicie eliminując resztkowe białka gospodarza. Analiza strony SDS - wykazała tylko trzy czyste pasma białek AAV Capsid (VP1/VP2/VP3).

 

Ryc. 1. Proces oczyszczania TFF bez środków powierzchniowo czynnych;(A) SDS - Page Gel Electroproforezis; (b) transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

 

Ryc. 1. Proces oczyszczania TFF z środkami powierzchniowo czynnymi;(a) SDS - elektroforeza żelowa; (b) Mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM)

 

3. Wyniki badań: wysoka czystość, aktywność i bezpieczeństwo

1. Efektywne usunięcie zanieczyszczeń:Nowa metoda osiągnęła 99,98% usunięcia HCPS i 95% usunięcia DNA, przy czym czystość jest porównywalna z chromatografią powinowactwa.
2. Poprawa zakaźności:Eksperymenty in vitro wykazały, że wektory AAV1 oczyszczone przy użyciu tej metody zainfekowały komórki HEK293 bardziej wydajnie niż te oczyszczone przez chromatografię powinowactwa (24,9% vs 20,8%), co wskazuje na lepsze zachowanie bioaktywności wirusowej.
3. Dobre bezpieczeństwo in vivo:Po lokalnym wstrzyknięciu oczyszczonych wektorów AAV1 w myszy mięsień szkieletowy nie zaobserwowano znacznego stanu zapalnego ani uszkodzenia tkanki po dwóch tygodniach, wykazując dobre bezpieczeństwo in vivo.
4. Szerokie zastosowanie serotypowe:Metoda z powodzeniem oczyszczyła wiele serotypów -, w tym supernatanty AAV1, AAV5, AAV8 i AAV9-FRM HOUTOR. Jednak w przypadku AAV2, który istnieje głównie w lizatach komórkowych o wysokim obciążeniu zanieczyszczeń, potrzebna jest dalsza optymalizacja.

 

4. Podsumowanie i perspektywy

W tym badaniu opracowano prosty, szybki (1,5 godziny), wydajny i skalowalny nowy proces oczyszczania AAV. Łącząc deoksycholan sodu i CHAPS, z powodzeniem rozwiązał wyzwanie resztkowej agregacji białek podczas oczyszczania TFF.

Zalety tej metody obejmują:

• Unikanie trudnych niskich warunków pH, lepiej zachowania aktywności wirusowej
• Zmniejszenie kroków chromatograficznych, uproszczenie przepływu pracy oraz oszczędzanie czasu i kosztów
• Łatwo skalowalne, odpowiednie do produkcji dużej przemysłowej -
• Zapewnienie nowej strategii oczyszczania innych biomakromolekuł, takich jak egzosomy, inne wirusy i rekombinowane przeciwciała

Obecne ograniczenia obejmują nieoptymalne odzyskiwanie wirusa i niezdolność do oddzielenia pustych kapsydów od pełnych cząstek wirusowych, co sugeruje, że jego najlepsze użycie może być jako pierwsze przechwytywanie kroku - w przepływie pracy oczyszczania kroku Multi -.

Podsumowując, badania te oferują nową atrakcyjną opcję produkcji wektorów AAV i mogą znacznie zmniejszyć koszty leków terapii genowej, ułatwiając ich szersze zastosowanie.