Zastosowanie ultrafiltracji w ekstrakcji kolagenu naturalnego

Kolagen, jako naturalny zasób białka, charakteryzuje się dobrą biokompatybilnością, niską antygenowością, biodegradowalnością i hemostazą, a także swoją zwartą strukturą helikalną i własnymi właściwościami, co stwarza warunki wstępne do jego industrializacji. Kolagen i jego produkty uboczne stosowane są nie tylko jako materiały opakowaniowe, kosmetyki i produkty ochrony zdrowia, ale także jako dodatki do żywności poprawiające jakość produktów mięsnych i odgrywają ważną rolę, szczególnie w medycynie.

 

Co to jest kolagen?

 

Kolagen to biologiczna makrocząsteczka, główny składnik zwierzęcej tkanki łącznej oraz najobficiej i najbardziej rozpowszechnione białko funkcjonalne u ssaków, stanowiące od 25% do 30% całkowitego białka, a w niektórych organizmach nawet do 80% lub więcej. Odgrywa rolę wiążącą tkankę w komórkach zwierzęcych.

Szacuje się, że w organizmie dorosłego człowieka znajduje się około 3 kg kolagenu, który występuje głównie w ludzkiej skórze, kościach, oczach, zębach, ścięgnach, narządach wewnętrznych (m.in. sercu, żołądku, jelitach, naczyniach krwionośnych) i innych częściach ludzkiego ciała, a jego funkcją jest utrzymanie morfologii i struktury skóry oraz tkanek i narządów, a także jest ważnym surowcem do naprawy różnych tkanek po urazach.

 

Istnieje wiele rodzajów białek kolagenowych, a popularne typy to typ I, typ II, typ III, typ V i XI. Ze względu na dobrą biokompatybilność, biodegradowalność i bioaktywność kolagen jest szeroko stosowany w żywności, medycynie, inżynierii tkankowej, kosmetyce i innych dziedzinach.

Jak wyodrębnić naturalny kolagen

Tkanki zwierzęce pochodzące od zwierząt gospodarskich i drobiu są dla ludzi głównym sposobem pozyskiwania naturalnego kolagenu i jego peptydów kolagenowych. Jednak ze względu na powiązane choroby zwierząt i pewne przekonania religijne, wykorzystanie przez ludzi kolagenu i jego produktów pochodzących od ssaków lądowych jest ograniczone, a rozwój stopniowo zwraca się w stronę organizmów morskich. Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) potwierdził, że nawet kolagen pochodzący z kości zwierzęcych nie może zakażać choroby szalonych krów ani innych powiązanych chorób. Ze względu na różnice w składzie aminokwasów i stopniu usieciowania zwierzęta wodne, zwłaszcza kolagen bogaty w odpady przetwórcze, takie jak skóra, kości i łuska, mają wiele zalet, których nie ma kolagen zwierzęcy. Ponadto kolagen pochodzący ze zwierząt morskich jest oczywiście lepszy od kolagenu ze zwierząt lądowych pod pewnymi względami, takimi jak niska antygenowość i hipoalergiczność. Dlatego kolagen wodny może stopniowo zastępować kolagen zwierzęcy lądowy. Jako przykład przyjęto proces ekstrakcji kolagenu z łusek karpia amurowego.

 

Ekstrakcja kolagenu z łusek karpia zwyczajnego metodą ultrafiltracji

1. Materiały i metody

1.1 Próbka testowa

Wodny ekstrakt kolagenu surowego.

1.2 Metody badań

1.2.1 Droga procesu ultrafiltracji

 

1.2.2 Określenie procesu filtracji wstępnej

W tym teście porównuje się i analizuje metodę filtracji próżniowej i metodę mikrofiltracji w celu określenia najlepszego procesu filtracji przed filtracją. Konkretne metody badań są następujące:

① Surowy ekstrakt wodny kolagenu przefiltrowano przez pompowanie próżniowe bibuły filtracyjnej w celu usunięcia zawieszonych cząstek i zanieczyszczeń w ekstrakcie wodnym.

② Surowy wodny ekstrakt kolagenu przefiltrowano przez membranę mikrofiltracyjną 0,2 µm w celu usunięcia nierozpuszczalnych substancji i zanieczyszczeń z ekstraktu wodnego.

 

1.2.3 Dobór wielkości porów membrany ultrafiltracyjnej

Wielkość porów membrany ultrafiltracyjnej wynosiła 100 kDa.

 

1.2.4 Doświadczenie jednoczynnikowe procesu oczyszczania ultrafiltracyjnego

Do oczyszczenia surowego ekstraktu wodnego kolagenu zastosowano technologię ultrafiltracji i przeprowadzono jednoczynnikowe eksperymenty dotyczące wpływu ciśnienia roboczego, temperatury roboczej i wartości pH na retencję kolagenu. Po uruchomieniu i ustabilizowaniu się urządzenia ultrafiltracyjnego na pewien czas zbadano wpływ różnych czynników na retencję kolagenu.

 

1.2.5 Wzór obliczeniowy

 

2. Wyniki i analiza

2.1 Wyniki analizy procesu filtracji wstępnej

Wyniki porównania dwóch metod filtracji: ekstrakcji próżniowej i mikrofiltracji przedstawiono w poniższej tabeli.

 

Z tabeli widać, że zarówno metoda filtracji próżniowej, jak i metoda mikrofiltracji mogą usunąć zanieczyszczenia i nierozpuszczalne ciała stałe z roztworu, ale metoda mikrofiltracji ma lepszy wpływ ochronny na białka, to znaczy strata nie jest oczywista, a metoda filtracji próżniowej jest łatwo spowodować utratę białek. Ponadto metoda filtracji próżniowej powoduje zmętnienie po umieszczeniu filtratu na pewien czas, a mikrofiltrat jest nadal przejrzysty i przezroczysty, dlatego mikrofiltrację wybiera się jako proces wstępnej obróbki ultrafiltracji.

 

2.2 Test jednoczynnikowy procesu ultrafiltracji

2.2.1 Wpływ ciśnienia ultrafiltracji na szybkość retencji

W warunkach temperatury 40 stopnia i pH=9.0 wpływ różnych ciśnień ultrafiltracji (0.07 MPa, {{9} }.0Badano 9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa i 0,15MPa) na retencję białek. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

Jak widać na powyższym rysunku, wraz ze wzrostem ciśnienia roboczego stopień retencji białek stopniowo maleje. Gdy ciśnienie robocze wynosi {{0}}.07 MPa, stopień retencji białka wynosi 96,53%, a przy ciśnieniu roboczym 0,15 MPa, współczynnik retencji białka wynosi 84,38%. Dzieje się tak, ponieważ efekt separacji ultrafiltracji substancji odbywa się poprzez różnicę ciśnień. W zakresie niskiego ciśnienia roboczego małe cząsteczki mogą szybko przejść przez membranę, natomiast duże cząsteczki mogą zostać uwięzione przez membranę ultrafiltracyjną i gromadzić się na powierzchni membrany. W tym czasie powierzchnia membrany i ekstrakt wodny tworzą różnicę stężeń, co skutkuje oporem na polaryzację stężenia. W tym czasie ciśnienie jest stosunkowo niskie i nie może mieć dużego wpływu na współczynnik retencji. Jednakże wraz ze wzrostem ciśnienia opór polaryzacji stężenia stopniowo wzrasta, a różnica stężeń pomiędzy powierzchnią membrany a ekstraktem wodnym osiąga równowagę. Gdy ciśnienie przekroczy tę równowagę, na powierzchni membrany może wytworzyć się warstwa żelu (co jest zgodne z teorią, że podczas ultrafiltracji tworzy się warstwa polaryzacji stężeniowej i kondensacyjnej), a ciśnienie w dalszym ciągu rośnie, grubość warstwy żelu wzrasta , a ilość białka pozostająca na powierzchni błony również wzrasta. Skutkuje to niższym współczynnikiem retencji. Aby zapewnić efekt separacji membrany, optymalnym parametrem ciśnienia roboczego jest 0,07 MPa.

 

2.2.2 Wpływ temperatury na retencję białek

W warunkach ciśnienia {{0}.11 MPa i pH=9.0 wpływ różnych temperatur, mianowicie 25 stopni, 30 stopni, 35 stopni, 40 stopni i 45 stopni, na białko badano retencję. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

Jak widać na powyższym rysunku, stopień retencji membrany ultrafiltracyjnej stopniowo wzrasta wraz ze wzrostem temperatury i osiąga maksimum w temperaturze 45 stopni, przy współczynniku retencji wynoszącym 97,01%. Dzieje się tak, ponieważ lepkość kolagenu jest ściśle związana z temperaturą. Gdy temperatura jest niska, lepkość kolagenu jest większa, a akumulacja kolagenu na powierzchni membrany łatwo tworzy opór, co skutkuje niskim współczynnikiem retencji. Gdy temperatura wzrasta, lepkość kolagenu maleje, oddziaływanie między cząsteczkami kolagenu jest osłabione, a szybkość przenoszenia masy wzrasta, zjawisko polaryzacji stężenia jest osłabione, a współczynnik retencji wzrasta. Innym powodem wzrostu współczynnika retencji jest wzrost temperatury, odpowiednio wzrasta również rozpuszczalność kolagenu i zmniejsza się zjawisko blokowania membrany przez kolagen, dlatego optymalna temperatura ultrafiltracji wynosi 45 stopni.

 

2.2.3 Wpływ wartości pH na retencję białek

W warunkach ciśnienia {{0}.11 MPa i temperatury 40 stopni wpływ różnych warunków pH, a mianowicie pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8,0, pH=9,0 i pH=10,0, badano szybkość retencji. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, stopień retencji stopniowo wzrasta wraz ze wzrostem wartości pH. Dzieje się tak dlatego, że membrana ultrafiltracyjna jest membraną z klonu polieterowego o ładunku ujemnym, a kolagen ma ładunek ujemny w warunkach zasadowych. Ujemnie naładowane cząsteczki kolagenu tworzą wzajemnie wykluczający się stan z membraną ultrafiltracyjną o tym samym ładunku, przez co cząsteczki kolagenu niełatwo utrzymać się na powierzchni membrany i blokować membranę. Dlatego optymalna wartość pH ultrafiltracji wynosi 8-10.

 

2.3 Optymalizacja procesu ultrafiltracji i weryfikacja wyników

Według analizy oprogramowania Design-Expert8.05 optymalne parametry procesu to: ciśnienie robocze 0,14 MPa, temperatura robocza 40,98 stopnia, pH roztworu{{7 }}.43, a wskaźnik retencji wynosi 92,551%. Biorąc pod uwagę realność rzeczywistych parametrów, warunki ultrafiltracji wybrano jako ciśnienie robocze 0,14 MPa, temperaturę pracy 40 stopni i wartość pH roztworu materiału 9,50, a weryfikację testu rozpoczęto po uruchomieniu i ustabilizowaniu układu ultrafiltracji. Wynik współczynnika retencji wyniósł (92,61±0,1)% (n=3). Przewidywane wartości równania są w zasadzie podobne do wartości zmierzonych, co pokazuje, że przewidywane wyniki parametrów stanu są zgodne z rzeczywistymi wynikami stanu.

 

2.4 Wyniki analizy elektroforetycznej

Oczyszczony kolagen analizowano metodą elektroforezy SDS-PAGE, a wyniki przedstawiono na poniższym rysunku.

 

Jak widać na powyższym rysunku, ścieżka 1 to oczyszczony kolagen z tego testu, a ścieżka 2 to standardowa próbka kolagenu ze ścięgna łydki. Z elektroforezy SDS-PAGE widać, że kolagen w tym badaniu można zidentyfikować jako kolagen, ale granice między łańcuchem peptydowym a1 i łańcuchem peptydowym a2 wydają się niejasne. Z mapy elektroforetycznej widać, że nie ma innych zanieczyszczeń białkowych, zatem można stwierdzić, że oczyszczony kolagen charakteryzuje się wysoką czystością.

O Guidlingu

 

Guidling Technology to krajowe przedsiębiorstwo high-tech skupiające się na biofarmaceutykach, hodowlach komórkowych, oczyszczaniu i zatężaniu biomedycyny, diagnostyce i płynach przemysłowych. Z powodzeniem opracowaliśmy urządzenia do filtrów odśrodkowych, kasety do ultrafiltracji i mikrofiltracji, filtry wirusowe, systemy TFF, filtry wgłębne, włókna kanalikowe itp., które w pełni spełniają scenariusze zastosowań biofarmaceutyków, hodowli komórkowych i tak dalej. Nasze membrany i filtry membranowe są szeroko stosowane w zatężaniu, ekstrakcji i separacji przed filtracją wstępną, mikrofiltracją, ultrafiltracją i nanofiltracją. Nasze liczne linie produktów, od małych jednorazowych filtrów laboratoryjnych po produkcyjne systemy filtracji, badania sterylności, fermentacja, hodowle komórkowe i inne, spełniają potrzeby testowania i produkcji. Guidling Technology z niecierpliwością czeka na współpracę z Tobą!