Badanie zdolności usuwania wirusów przez przeciwciała monoklonalne w dalszym procesie
Produkty biotechnologiczne pochodzące z linii komórkowych mogą być narażone na ryzyko skażenia wirusami – stopień zależy od wielu czynników, w tym od źródła preparatu, użytych surowców, systemu produkcyjnego, odczynników oczyszczających i substancji pomocniczych. Badanie usuwania lub inaktywacji wirusów w procesie produkcyjnym jest kluczowym krokiem w ograniczaniu możliwości jatrogennego przenoszenia patogennych wirusów, a tym samym zmniejszaniu ryzyka, które jest istotne dla bezpieczeństwa produktów. Zanim produkty biologiczne będą mogły wejść do badań klinicznych i zostać wprowadzone do obrotu, należy wykazać, że proces ich produkcji pozwala na usunięcie znanych i przypuszczalnych wirusów.
01 Ocena bezpieczeństwa produktu będącego wirusem będącym przeciwciałem monoklonalnym
Badanie zdolności usuwania wirusa polega zwykle na dodaniu znanego wirusa wskaźnikowego miana do produktu pośredniego na różnych etapach produkcji, następnie określeniu miana wirusa resztkowego w próbce poddanej określonemu procesowi i na koniec ocenie wartości redukcji logarytmicznej (LRV). miana wirusa. Etapy procesu dla LRV Większe lub równe 4log10 są ogólnie uważane za skuteczne etapy usuwania wirusów. Proces z LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.
W przypadku stosowania metody symulowanego procesu produkcyjnego (procesu zredukowanego) konieczne jest zaprojektowanie rozsądnego planu badań i testów w zakresie usuwania/inaktywacji wirusów, powiązanego w miarę możliwości z rzeczywistym procesem produkcyjnym, zwłaszcza z efektywnymi etapami procesu produkcyjnego. Symulowany proces powinien być ściśle zgodny z procesem rzeczywistym pod względem parametrów badania i warunków kontroli.
02 Powszechnie oznacza wirusy i schematy weryfikacji
Typowe wirusy wskaźnikowe przedstawiono w Tabeli 1.
Na etapie eksperymentalnego stosowania nowego leku (IND) produkt biotechnologiczny wymaga badań eliminacji wirusa dla co najmniej 2 wirusów modelowych, zazwyczaj wybierając jeden retrowirus (X-MuLV) i jeden parwowirus (MMV). Na etapie składania wniosku o licencję na leki biologiczne (BLA) badania usuwania wirusów są zazwyczaj przeprowadzane przy użyciu 3-5 wirusów specyficznych/nieswoistych i oceniane są 3-5 etapy procesu w celu wykazania, że produkt ma odpowiedni współczynnik bezpieczeństwa na podstawie perspektywa bezpieczeństwa wirusów. Ze względu na różne wytyczne w kraju i za granicą istnieją pewne różnice w etapach weryfikacji usuwania wirusów stosowanych w przypadku deklaracji. Powszechnie stosowane schematy weryfikacji usuwania wirusa w procesie produkcji mAb przedstawiono w Tabeli 2.
03 Możliwość usuwania wirusów z dalszych procesów
3.1 Zdolność dalszych procesów do usuwania różnych wirusów
Od 2009 r. produkty przeciwciał monoklonalnych przedkładane FDA w celu sprawdzenia IND i BLA, chromatografii powinowactwa do białka A, niskiego pH, chromatografii anionowymiennej AEX (tryb penetracji przepływowej), chromatografii kationowymiennej CEX (tryb wiązania - elucja) i walidacji usuwania wirusa z wyłączeniem filtracja wirusów to najczęściej stosowane rodziny wirusów wskaźnikowych, a średnią i zakres ich efektów usuwania przedstawiono na rycinie 1.
W przypadku retrowirusów, z wyjątkiem CEX, którego LRV wynosi około 3log10 (jak pokazano na wykresie słupkowym na ryc. 1), pozostałe procesy były solidne (LRV większe lub równe 4log10). Wirusy opryszczki i retrowirusy mają podobny efekt usuwania i LRV > 4log10 (jak pokazano na wykresie słupkowym B na Ryc. 1). Małe wirusy bez otoczki, takie jak parwowirus, są trudniejsze do skutecznego usunięcia, są odporne na obróbkę chemiczną i nie dają się łatwo wyłapać przez filtry (pokazane na wykresie słupkowym C na Ryc. 1). Tylko AEX i małe filtry wirusowe były skuteczne w usuwaniu parwowirusów (średnie LRV > 4log10).
Procesy pokazane na Figurze 1 to ProteinA, AEX (tryb penetracji przepływowej), CEX (tryb mieszania-elucji), inaktywacja przy niskim pH („niepełne” w porównaniu z „całkowitym” usunięciem) oraz filtracja dewirusowa o dużej i małej aperturze.
3.2 Czynniki wpływające na dalsze procesy na zdolność usuwania wirusów
Rozkład wartości LRV dla każdego procesu przedstawiono na rysunku 2. Badania z 0 ~ 21og10 zostały sklasyfikowane jako grupa o niskim LRV, a te z większym niż 6log10 zostały sklasyfikowane jako grupa o wysokim LRV do analizy porównawczej.
3.2.1 Chromatografia powinowactwa do białka A
Nie stwierdzono istotnej korelacji pomiędzy wartością LRV procesu z białkiem A a buforem równoważącym/płukaniem, wypełniaczem, składem eluentu i wartością pH elucji. Wspólnym mianownikiem grupy o niskim LRV jest to, że surowiec jest dość złożony i może się zdarzyć, że złożone oddziaływanie surowca i wypełniacza negatywnie wpływa na zdolność kolumny chromatograficznej do usuwania wirusów.
3.2.2 AEX (tryb przepływowy)
Strauss i in. wykazało, że pH i przewodność próbek AEX mogą wpływać na LRV. Jednak wyniki statystyczne Miesegaes i wsp. wykazały, że podobnie jak w przypadku ProteinA, LRV AEX (tryb penetracji przepływu) nie wykazywało istotnej korelacji z różnymi buforami, wypełniaczami, pH i przewodnością, co może wynikać z optymalizacji pH i przewodności w zgłoszonych warunkach procesu.
3.2.3 CEX (wiązanie – tryb elucji)
Usuwanie wirusów metodą CEX nie jest wystarczająco skuteczne. Nie stwierdzono istotnej korelacji pomiędzy LRV w grupie o wysokim LRV a buforem, poziomem doświadczenia lub jakimikolwiek właściwościami kolumny chromatograficznej, takimi jak wysokość kolumny i rodzaj żywicy. Jednakże wartości pH równowagi/obciążenia i elucji zastosowane w badaniu z wysokim LRV były niższe i wynosiły 5,3±0,2; W grupie z niskim LRV pH wynosiło 6,0±0,2. Innym czynnikiem jest to, że stężenie soli w buforze może również powodować różnicę wartości LRV. Bufor zastosowany w badaniu o niskim LRV miał wyższe stężenie soli, średnio wynoszące 290±120 mM w roztworze obciążającym/równoważącym i 340±70 mM w eluencie, natomiast stężenia NaCl w badaniu o wysokim LRV wynosiły 58 Odpowiednio ±27 mM i 183±31 mM.
3.2.4 Inaktywacja przy niskim pH
W procesie o niskim pH pH jest kluczowym parametrem procesu, a pH wynoszące 3,8 jest wystarczające do stopniowej inaktywacji retrowirusa. W grupie o niskim LRV pH wynosiło 3,9, podczas gdy w badaniu o wysokim LRV pH wynosiło 3,4.
3.2.5 Usuwanie filtrowania wirusów
Zarówno w przypadku filtrów o małej, jak i dużej aperturze wartość LRV usunięcia MuLV była nie mniejsza niż 2log10, a tylko 1% badań miała wartość poniżej 3log10 (pokazaną w kolumnach h i i na Ryc. 2). Całkowity klirens retrowirusów przez filtry wirusów o dużej aperturze był niższy niż przez filtry wirusów o małej aperturze (jak pokazano na wykresie słupkowym C na Ryc. 1). Głównym powodem wpływającym na wynik usuwania parwowirusa są różne typy filtrów. Ogólnie rzecz biorąc, filtrowanie antywirusowe może niezawodnie usuwać wirusy.
Procesy te obejmują białko A(a), tryb penetracji AEX (b), wiązanie CEX – tryb elucji (c), wiązanie AEX Ⅰ tryb elucji (d), inaktywację przy niskim pH („niepełne” i „całkowite” klirens) (e ~ g) oraz duży rozmiar porów (h) i mały rozmiar porów (i ~ j) filtracja dewirusowa (gdzie a ~ i: retrowirus; j: parwowirus).
04 Innowacje i wyzwania w ocenie bezpieczeństwa wirusowego
Ciągły rozwój i innowacje w dziedzinie dalszych procesów biofarmaceutycznych nieuchronnie doprowadzą do innowacji w ocenie usuwania wirusów. Postępy w procesach poprzedzających i końcowych, takich jak bioprocesy ze strumieniem ciągłym, spowodowały konieczność oceny i ustalenia skutecznych i solidnych procesów usuwania wirusów. Podczas przepływu ciągłego oczekuje się, że etapy takie jak inaktywacja i filtrowanie wirusów będą nadal wykonywane w trybie wsadowym. Chociaż zdolność usuwania wirusów w procesach chromatograficznych w trybie przepływu ciągłego nie powinna zasadniczo różnić się od zdolności przetwarzania wsadowego, musi być poparta danymi.
05 Perspektywy
Z punktu widzenia bezpieczeństwa wirusologicznego doskonałe bezpieczeństwo przemysłu biofarmaceutycznego można w dużej mierze przypisać ścisłemu przestrzeganiu przez branżę trzech kluczowych strategii bezpieczeństwa wirusologicznego: odpowiednie pozyskiwanie i testowanie źródeł materiałów i banków komórkowych, dokumentowanie ocen eliminacji wirusa (badania walidacyjne wirusa) oraz przeprowadzanie testów wirusologicznych w trakcie procesu. Charakterystyka leków biologicznych wytwarzanych przez nowe substraty komórkowe może zmieniać się w zależności od różnych zagrożeń, dlatego aby zapewnić bezpieczeństwo leków biologicznych, wymagane są dobre strategie zarządzania ryzykiem. Guidling Technology ma doświadczony profesjonalny zespół techniczny, obejmujący proces filtracji od małej próby, próby pilotażowej po produkcję na dużą skalę. Nasze filtry membranowe i membranowe są szeroko stosowane w filtracji wstępnej, mikrofiltracji, ultrafiltracji, zatężaniu nanofiltracji, ekstrakcji i separacji; Nasze liczne linie produktów, od małych jednorazowych filtrów laboratoryjnych po systemy filtracji zorientowane na produkcję, testy sterylności, fermentacja, hodowle komórkowe i inne, zapewniają zwiększoną produktywność.
Jiuling, aby zapewnić jakość produktu jako pierwszy wskaźnik, w dążeniu do „obniżenia kosztów, zwiększenia wydajności” na drodze do odkrycia, nie mogę się doczekać współpracy z Tobą w przyszłości, aby stawić czoła wyzwaniom branży i szukać lepszego rozwoju.
