Badanie dotyczące zastosowania głębokiej filtracji w procesie produkcji szczepionki przeciwko pryszczycy
Przedmowa - Co to jest pryszczyca
W XIV wieku istnieją pisemne wzmianki o podobnej pryszczycy w Europie. Pryszczyca jest ostrą, gorączkową i wysoce zaraźliwą chorobą wywoływaną przez wirusa pryszczycy.
Do objawów klinicznych dorosłych zwierząt zalicza się: podwyższoną temperaturę ciała, pęcherze i owrzodzenia w jamie ustnej, pęcherze i owrzodzenia na kopytach, a nawet złuszczanie łuski kopyt, powodujące trudności w jedzeniu i spaniu, utratę masy ciała, a nawet utratę wartości ekonomicznej u zwierząt gospodarczych. ;
Do objawów klinicznych młodych zwierząt zalicza się: podwyższoną temperaturę ciała, zapalenie mięśnia sercowego i inne objawy. Po wystąpieniu choroby młode zwierzęta charakteryzują się dużą śmiertelnością.
Abstrakcyjny
W ciągu ostatnich 500 lat na całym świecie wielokrotnie wybuchała pryszczyca, a duża liczba świń, bydła, owiec i innych zwierząt domowych oraz dzikich parzystokopytnych padła lub zachorowała, co poważnie wpływa na zwierzęta gospodarskie i branży hodowlanej.
W celu zbadania zastosowania technologii głębokiej filtracji w procesie produkcji szczepionki przeciwko pryszczycy zbadano i porównano filtrowalność filtracji powierzchniowej i głębokiej oraz ochronny wpływ na filtrację bakteriobójczą. Zbadano zalety głębokiej filtracji o wysokim ładunku w usuwaniu resztek komórkowych. Przeanalizowano odpowiednie schematy filtracji dla pożywek do hodowli komórkowych o różnym zmętnieniu.
Wyniki wykazały, że obciążenie filtracją głęboką było 13,9 razy większe niż w przypadku filtracji powierzchniowej, zmętnienie cieczy filtracyjnej stanowiło tylko 23,5% obciążenia filtracji powierzchniowej, a kolejny ładunek debakteryjny 0.2um był 7,2 razy większy niż w przypadku filtracji powierzchniowej filtracja powierzchniowa. Dzięki zastosowaniu specjalnego ligandu żywicznego zmętnienie cieczy filtracyjnej wynosi 38,6% w porównaniu ze zwykłym filtrem głębokim o tej samej wielkości porów, co jest korzystne dla ochrony dalszego procesu. Wyniki wykazały, że głęboka filtracja, zwłaszcza głęboka filtracja z silnym ładunkiem dodatnim, może być skutecznie stosowana w produkcji szczepionki przeciw pryszczycy, dlatego należy opracować odpowiednie procesy filtracji dla różnych pożywek hodowlanych.
Pryszczyca i głęboka filtracja
Pryszczyca (FMD) jest ostrą, gorączkową i zakaźną chorobą zwierząt parzystokopytnych, wywoływaną przez wirusa pryszczycy (FMDV). Zwierzęta najbardziej podatne na tę chorobę to bydło, świnie i owce. Pryszczyca występuje endemicznie w Azji, Afryce, na Bliskim Wschodzie i w Ameryce Południowej, charakteryzuje się bardzo dużą częstością występowania i szybkim przenoszeniem. Światowa Organizacja Zdrowia Zwierząt (OIE) zalicza ją do pierwszej kategorii chorób odzwierzęcych A, wymagając od państw członkowskich umieszczenia pryszczycy na liście chorób zwierząt podlegających obowiązkowi zgłoszenia. Szczepienia są skuteczną metodą swoistej profilaktyki pryszczycy. Inaktywowana szczepionka przeciw pryszczycy, otrzymywana poprzez inaktywację nienaruszonego wirusa za pomocą inaktywatora, odgrywa ważną rolę w zapobieganiu i zwalczaniu pryszczycy.
Antygenowość samego FMDV jest słaba, a inaktywacja wirusa ma ogromny wpływ na jego antygen. Dlatego przy obecnej produkcji szczepionki przeciw pryszczycy, szczepionka przeciw pryszczycy o wysokiej czystości może zapewnić zawartość antygenu i czystość dawki jednostkowej, co jest szczególnie ważne i stanowi również obecną strategię szczepień. Stawia to wysokie wymagania dotyczące dalszego oczyszczania wirusów. Ponadto przed 2009 r. producenci inaktywowanych szczepionek przeciwko pryszczycy w Chinach przyjmowali głównie metodę hodowli polegającą na obracaniu butelki i przyklejaniu jej do ścianki. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na szczepionki stopniowo ujawniały się wady tej metody hodowli, wymagające dużej liczby obracających się butelek, niskiej wydajności i niskiego poziomu ekspresji.
Dlatego w ostatnich latach technologia hodowli komórkowych powoli zmieniała się z dotychczasowej hodowli przylegającej na kulturę zawiesinową, a produkcja wirusa uległa znacznej poprawie. Jednakże wraz ze wzrostem produkcji wirusa zmiana trybu hodowli spowodowała większy nacisk na dalsze oczyszczanie, ponieważ odpowiednio wzrosły pozostałości komórkowe generowane w procesie hodowli, uwalnianie przez komórki białek gospodarza, DNA gospodarza itp., co nakłada dalsze wymagania na zdolność dalszego oczyszczania.
Technologia filtracji membranowej jest szeroko stosowana w procesie produkcji produktów biologicznych, takich jak szczepionki, wśród których technologia filtracji DC jest zwykle stosowana w procesie zbierania jadu choroby w celu oddzielenia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, takich jak resztki komórek. We wczesnym wyjaśnieniu FMDV przyjęto głównie technologię filtracji powierzchniowej reprezentowaną przez składany element filtrujący membranowy. Wraz ze zmianą warunków hodowli, wzrostem zanieczyszczeń resztek komórkowych, filtracja powierzchniowa jest trudna do osiągnięcia efektu klarowania, a ponieważ obciążenie filtracją powierzchniową jest niskie, koszt materiałów filtracyjnych staje się coraz wyższy.
W związku z powyższym w procesie separacji cytocieczy FMDV coraz częściej stosuje się głęboką filtrację. Głęboki materiał filtracyjny składa się zwykle z długich i drobnych włókien pochodzących ze źródeł naturalnych, a kanał utworzony przez medium filtracyjne po utworzeniu folii jest często bardzo kręty, podobnie jak struktura apertury labiryntowej. Cząsteczki zanieczyszczeń często są zatrzymywane wewnątrz filtra, a nie na jego powierzchni. Co więcej, ścianka kanału filtra często pochłania część bardzo drobnych zanieczyszczeń w wyniku działania elektrostatycznego lub siły międzycząsteczkowej. Ogólnie mechanizm filtracji głębokiej filtracji charakteryzuje się mechaniczną retencją i adsorpcją.
Metoda filtracji stałoprądowej
Zamontować głęboką płytkę filtracyjną na urządzeniu filtrującym prąd stały, przemyć płytkę filtracyjną buforem PBS powyżej 54 L/m2; Po zakończeniu mycia uruchom pompę perystaltyczną, aby powoli pompować ciecz, powoli dostosuj prędkość pompy do oczekiwanego natężenia przepływu i przefiltruj ciecz. Rejestruj objętość filtracji, czas, różnicę ciśnień i zmętnienie podczas procesu filtracji. Przesącz zebrano w celu wykrycia antygenu.
Zalety głębokiej filtracji
Filtracja powierzchniowa to technologia wychwytywania cząstek na powierzchni materiału filtrującego w celu osiągnięcia filtracji. Mechanizm filtracji opiera się głównie na wielkości cząstek na sicie płynu, duże cząstki są wychwytywane na powierzchni membrany filtra. Głęboka filtracja wykorzystuje wewnętrzne kanały do przechwytywania i adsorpcji cząstek na głębokości. Schemat porównawczy obu rozwiązań pokazano na rysunku 1.
Inaktywowany roztwór szczepionki przeciwko pryszczycy określonego producenta został wstępnie przefiltrowany odpowiednio przez polipropylenową membranę powierzchniową o średnicy 0,45 um i głęboką płytkę filtracyjną, a następnie przefiltrowany przez filtr bakteriobójczy o średnicy 0,2 um. Dane dotyczące filtrowalności przedstawiono w tabeli 1.
Zmętnienie roztworu inaktywowanej szczepionki przeciw pryszczycy wynosi 77 NTU. Jeśli bakterie zostaną odfiltrowane bezpośrednio, duża liczba fragmentów komórek nieuchronnie spowoduje szybkie zablokowanie membrany filtra 0.2um, co wpłynie na transmisję vicząstek 146S. Dlatego też zaprojektowano filtrację wstępną przed filtracją debakteryjną i porównano dwie metody filtracji wstępnej: filtrację głęboką i filtrację powierzchniową. Do filtracji wybierana jest dwuwarstwowa głęboka płyta filtracyjna, obciążenie wynosi 641 L/m2, a głęboki filtr redukuje materiał z 77 NTU do 9,65 NTU, który jest przejrzysty i jasny. Obciążenie filtracji powierzchniowej wynoszące 0.45um wynosi zaledwie 46 L/m2, a zmętnienie cieczy filtracyjnej sięga aż 41 NTU, co nie nadaje się do filtracji wstępnej. Zgodnie z porównaniem kolejnego wsadu filtracyjnego pozbawionego bakterii o wartości 0.2um, obciążenie pozbawionej bakteryjnej membrany filtracyjnej po głębokiej filtracji wynosi 655 L/m2, co stanowi 7,2-krotność odpowiedniego obciążenia filtracyjnego w przypadku filtracji powierzchniowej (tylko 91 L/m2) .
Wyniki testu 146S pokazują, że wydajność systemu głębokiej filtracji jest wyższa niż wydajności systemu filtracji powierzchniowej. Wkład filtracji głębokiej był 13,9 razy większy niż w przypadku filtracji powierzchniowej, zmętnienie cieczy filtracyjnej stanowiło tylko 23,5% w porównaniu z filtracją powierzchniową, a kolejny wsad filtracyjny usuwający bakterie 0.2um był 7,2 razy większy niż w przypadku filtracji powierzchniowej filtracja powierzchniowa. Dlatego zarówno z punktu widzenia kosztów, jak i wydajności, system głębokiej filtracji jest znacznie lepszy niż system filtracji membranowej powierzchniowej.
Zalety silnego, głębokiego filtra z ładunkiem dodatnim
Do porównania inaktywowanego roztworu szczepionki przeciwko pryszczycy pochodzącej z różnych źródeł wykorzystano płytkę głębokiego filtra z ładunkiem dodatnim i płytkę głębokiego filtra z silnym ładunkiem dodatnim. Wyniki filtrowalności przedstawiono w tabeli 2, a zmianę prędkości filtracji i różnicy ciśnień w procesie filtracji przedstawiono w układzie kolorów 2.
Obie grupy zastosowanych głębokich płytek filtracyjnych mają tę samą dokładność apertury, a wydajność jest bardzo spójna z punktu widzenia zmiany obciążenia i różnicy ciśnień, a krzywa zmiany różnicy ciśnień na rysunku 2 jest zasadniczo identyczna.
Jednak z powodu zmętnienia cieczy filtracyjnej różnica jest bardzo duża. Ciecz filtracyjna zwykłej, dodatnio naładowanej dwuwarstwowej płyty filtracyjnej wynosi 25 NTU, podczas gdy ciecz filtracyjna silnie dodatnio naładowanej głębokiej płyty filtracyjnej o tej samej aperturze wynosi tylko 9,65 NTU, co stanowi tylko 38,6% zwykłej głębokiej płyty filtracyjnej. Dzieje się tak głównie ze względu na specjalny ligand żywiczny w materiale filtracyjnym głębokiej płyty filtracyjnej o silnym ładunku dodatnim. Dzięki silnie dodatniej dwuwarstwowej płycie filtracyjnej zmętnienie jest redukowane do wartości poniżej 10 NTU, a fragmenty komórek są w pełni adsorbowane lub wychwytywane, co sprzyja późniejszemu procesowi ultrafiltracji lub filtracji bakteriobójczej. Oprócz efektu adsorpcji nierozpuszczalnych resztek komórkowych, Yigzaw Y i wsp. opisali również efekt usuwania silnie dodatnio naładowanej głębokiej płytki filtracyjnej na białko gospodarza komórkowego, a Dorsey N i wsp. opisali efekt usuwania silnie dodatnio naładowanej głębokiej płytki filtracyjnej na DNA.
Opracowanie procesu filtracji klarującej supernatantu szczepionki przeciw pryszczycy metodą głębokiej filtracji
Dzięki powyższemu badaniu porównawczemu filtracji powierzchniowej i głębokiej filtracji oraz badaniu efektu klarowania specjalnej głębokiej płytki filtracyjnej o silnym ładunku dodatnim, należy dopasować różne schematy filtracji do inaktywowanego supernatantu szczepionki przeciw pryszczycy wyprodukowanej w różnych warunkach warunki kultury. W przypadku supernatantu odśrodkowego o 3 różnych zmętnieniach, niskim zmętnieniu, średnim zmętnieniu i wysokim zmętnieniu, schemat głębokiej filtracji i odpowiadające im parametry filtracji pokazano w Tabeli 3.
W przypadku odwirowanego supernatantu o niskim zmętnieniu, jednowarstwowa głęboka płytka filtracyjna może skutecznie klarować i usuwać niewielką ilość resztek komórkowych. W przypadku odśrodkowego supernatantu o średnim zmętnieniu, dwuwarstwowa głęboka płyta filtracyjna może skutecznie klarować, szczególnie głęboka płyta filtracyjna o silnym ładunku dodatnim może zmniejszyć zmętnienie do mniej niż 5 NTU; W przypadku supernatantu odwirowanego o większym zmętnieniu można skutecznie sklarować połączoną płytkę filtracyjną. Bez względu na proces, wydajność przetwarzania wynosi 500 ~ 800 L/m2, zmętnienie cieczy filtracyjnej jest mniejsze niż 20 NTU, a docelowy antygen jest w pełni odzyskany, odpowiedni do produkcji na dużą skalę.
Dyskusja
W latach siedemdziesiątych XX wieku określono, że w materiałach filtracyjnych nie stosuje się materiałów azbestowych ze względu na obecność czynników rakotwórczych w materiałach azbestowych. Głęboki materiał filtracyjny nie zawiera azbestu i ma silniejszy ładunek dodatni. Materiał filtracyjny składa się z matrycy z włókien drzewnych i materiału filtrującego. W procesie produkcyjnym do łączenia podstawowych składników wykorzystuje się żywicę polimerową, a zawarte w niej grupy funkcyjne ładunku dodatniego skutecznie zapewniają zdolność głębokiego materiału filtrującego do adsorpcji ładunku. Doskonałe działanie głębokiej filtracji adsorpcyjnej na zdolność wychwytywania drobnych cząstek pokazano na rysunku 3.
W tym eksperymencie wybrano różne składniki żywicy i różne precyzyjne materiały do głębokiego filtrowania, aby wyjaśnić test filtracji roztworu hodowli FMDV, a test porównawczy przeprowadzono z filtracją powierzchniową. Wyniki wykazały, że filtracja głęboka była bardziej odpowiednia do usuwania resztek komórkowych niż filtracja powierzchniowa, co sprzyjało późniejszej jednostce filtracyjnej z kontrolą obciążenia mikrobiologicznego (0,2um). Ponadto, porównując efekt filtracji głębokiej płytki filtrującej z silnym ładunkiem dodatnim i zwykłej płytki głębokiego filtra z ładunkiem dodatnim, płyta filtrująca z silnym ładunkiem dodatnim wykazuje dużą zdolność kontroli zmętnienia, co może zmniejszyć zmętnienie do mniej niż 5 NTU, co bardzo sprzyja poprawie wytrzymałości całego procesu filtracji.
Proces hodowli poprzedzającej ma ogromny wpływ na etapy zbierania składników aktywnych. Dzięki testom w tym eksperymencie ostatecznie ustalono skalowalny schemat filtracji dla pożywek do hodowli komórkowych o różnym zmętnieniu, co ma pewne znaczenie przewodnie w przypadku produkcji na dużą skalę.
Filtr wgłębny, który zostanie wprowadzony na rynek przez Guidling Technology, to element filtrujący typu dyskowego, będący rodzajem wydajnego elementu filtrującego z głębokim kartonem filtracyjnym jako materiałem filtrującym, w pełni spełniający wymagania regulacyjne dotyczące produktów biofarmaceutycznych, zaprojektowany i wyprodukowany głównie specjalnie do usuwania duże zawartości substancji stałych, takich jak komórki i fragmenty komórek, i można je stosować do płynu z hodowli komórek ssaków; Wyjaśnianie lizatu bakterii i komórek drożdży; Usuwanie białka komórki gospodarza (HCP); Usuń wirusa i nazwę wyróżniającą; Usuwanie endotoksyn; Usuwanie środka przeciwpieniącego.
Produkt ma zalety małej objętości martwej, wzmocnienia liniowego, struktury kapsuły dyskowej, zwartej konstrukcji i może być stosowany szeregowo z innym sprzętem, małej powierzchni, stabilnego natężenia przepływu, długiej żywotności i niskich kosztów.
