Pełna analiza procesu wytwarzania leku MRNA: jak technologia TFF rozwiązuje problemy związane z oczyszczaniem
W ostatnich latach technologia mRNA osiągnęła przełomowy postęp w dziedzinie biofarmaceutyki, wykazując ogromny potencjał aplikacyjny, szczególnie w szczepionkach i terapii genowej. Pomyślny rozwój szczepionek mRNA nie tylko zapewnił nowe rozwiązania w zakresie zapobiegania i kontroli chorób zakaźnych, ale także przyczynił się do postępu w immunoterapii nowotworów i medycynie spersonalizowanej. Jako nowa klasa produktów terapeutycznych, wytwarzanie mRNA na dużą-skalę stanowi duże wyzwanie, obejmujące kontrolę stabilności RNA, usuwanie resztkowych enzymów i produktów ubocznych-reakcji, wymianę buforu oraz osiągnięcie wysokiego-stopnia odzyskiwania czystości, a wszystko to wymaga technologii produkcyjnych z rozwiązaniami zatwierdzonymi-regulacyjnie.
Proces wytwarzania szczepionek mRNA lub środków terapeutycznych dzieli się głównie na trzy etapy: przygotowanie roztworu zbiorczego plazmidowego DNA, przygotowanie roztworu zbiorczego mRNA i przygotowanie produktu leczniczego mRNA – LNP.
Schemat blokowy procesu wytwarzania leku mRNA
Filtracja z przepływem stycznym (TFF), jako-ugruntowana technologia separacji membranowej, jest szeroko stosowana w produkcji mRNA ze względu na jej-wysoką skuteczność w przesiewaniu molekularnym, kontrolowaną wymianę buforu i niskie naprężenia ścinające. W oparciu o konstrukcję modułów membranowych typowe konfiguracje TFF obejmują kasety-z płaskimi arkuszami i moduły-z pustych włókien. Ponadto separację membranową-ciśnieniową w TFF można podzielić na mikrofiltrację (MF), ultrafiltrację (UF), nanofiltrację (NF) i odwróconą osmozę (RO) w zależności od wielkości porów membrany, ze stopniowo rosnącą selektywnością.
TFF odgrywa kluczową rolę na wielu etapach wytwarzania leków mRNA, w tym w przygotowaniu masy plazmidowego DNA, masowej produkcji mRNA i końcowej formulacji produktów leczniczych mRNA–LNP. Poprzez odpowiedni dobór typu membrany, punktu odcięcia-masy cząsteczkowej (MWCO) i materiału membrany, TFF umożliwia skuteczne usuwanie-produktów reakcji i zanieczyszczeń o niskiej-masie cząsteczkowej-, ułatwiając jednocześnie wymianę i zatężanie buforu zarówno przed, jak i po kapsułkowaniu LNP. Znacząco poprawia to czystość, stabilność i ogólną skalowalność procesu RNA.
Ponadto na wydajność filtracji z przepływem stycznym wpływają czynniki konfiguracji systemu, takie jak typ pompy i konstrukcja rurki, a także kluczowe parametry procesu, w tym ciśnienie transmembranowe (TMP), naprężenie ścinające i strumień filtracji. Czynniki te muszą być starannie dobrane i zoptymalizowane w oparciu o charakterystykę produktu docelowego, szczególnie w przypadku produktów-wrażliwych na stres, takich jak mRNA–LNP, które są bardzo podatne na zewnętrzne siły mechaniczne podczas przetwarzania.
Oczyszczanie plazmidowego DNA
Przygotowanie roztworu podstawowego plazmidowego DNA zasadniczo opiera się na projekcie sekwencji matrycy transkrypcyjnej. Metody przygotowania zazwyczaj obejmują amplifikację plazmidowego DNA, chociaż można również zastosować amplifikację PCR. Biorąc na przykład amplifikację DNA, inżynierięE. colijest powszechnie stosowany do amplifikacji-na drodze fermentacji. Dalszy proces oczyszczania obejmuje głównie zbieranie komórek, lizę i klarowanie, zatężanie i wymianę buforu, sterylną filtrację, linearyzację i oczyszczanie chromatograficzne. W warunkach przemysłowych do zbierania komórek często stosuje się wirowanie-z przepływem ciągłym, ale generuje ono stosunkowo duże siły ścinające. Systemy pustych włókien, z otwartymi kanałami i niskim poziomem ścinania, są bardziej odpowiednie do obsługi próbek o dużej zawartości części stałych, dużej lepkości lub wrażliwości na ścinanie, takich jak plazmidowy DNA. Po pobraniu komórki poddaje się-homogenizacji pod wysokim ciśnieniem, działaniu ultradźwięków lub lizie alkalicznej, a następnie wstępnemu klarowaniu poprzez filtrację wgłębną.
Aby ułatwić późniejszą chromatografię, w pierwszej kolejności do zatężania i wymiany buforu często stosuje się filtrację z przepływem stycznym (TFF) przy użyciu kaset membranowych lub kolumn z pustymi włóknami o wartościach odcięcia-masy cząsteczkowej wynoszącej 30 kDa, 100 kDa lub 300 kDa. Zmniejsza to objętość próbki, jednocześnie usuwając niektóre zanieczyszczenia, takie jak RNA, białka komórki gospodarza (HCP) i fragmenty DNA komórki gospodarza (HCD). Chromatografia służy jako etap oczyszczania rdzenia. Zazwyczaj chromatografię anionowymienną (AEX) łączy się z chromatografią oddziaływań hydrofobowych (HIC), aby skutecznie usunąć zanieczyszczenia i wzbogacić wysoce bioaktywny superskręcony plazmidowy DNA, znacznie poprawiając w ten sposób czystość plazmidu.
Po oczyszczeniu plazmid ponownie poddaje się TFF w celu zatężenia roztworu do docelowego stężenia (zwykle 0,5–2 mg/ml) i przeprowadzenia dializy z końcowym buforem do przechowywania. Na tym etapie usuwa się z procesu resztkowe sole i rozpuszczalniki organiczne, zapewniając, że układ buforowy spełnia wymagania dalszych reakcji transkrypcji in vitro (IVT).
Oczyszczanie mRNA transkrybowanego in vitro (IVT).
Transkrypcja in vitro (IVT) i modyfikacja to kluczowe procesy przygotowania roztworów podstawowych mRNA. Podczas wytwarzania mRNA IVT stosuje się kombinację filtracji z przepływem stycznym (TFF1) – chromatografii – filtracji z przepływem stycznym (TFF2). Strategia ta zapewnia wydajne-oczyszczanie mRNA o wysokiej jakości, zapewniając krytyczne wsparcie przy produkcji szczepionek.
Po zakończeniu reakcji transkrypcji i modyfikacji zazwyczaj najpierw przeprowadza się ultrafiltrację/diafiltrację przy użyciu kaset membranowych lub kolumn z pustymi włóknami z wartościami odcięcia-masy cząsteczkowej wynoszącej 30 kDa, 100 kDa lub 300 kDa. Ten etap skutecznie usuwa różne zanieczyszczenia-związane z procesem z układu reakcyjnego, takie jak polimeraza RNA, resztkowe fragmenty DNA, nieprzereagowane NTP, enzymy zamykające, dwu-niciowy RNA (dsRNA) i drobno-inhibitory, jednocześnie osiągając wymianę buforu. Po pojedynczym etapie filtracji z przepływem stycznym większość zanieczyszczeń zostaje skutecznie usunięta, a jedynym wykrywalnym resztkowym zanieczyszczeniem białkowym jest polimeraza RNA.
Następnie do dalszego oczyszczania stosuje się wiele technik chromatograficznych. Powszechnie stosowane metody obejmują chromatografię powinowactwa, chromatografię-wykluczania, chromatografię-par jonowych z odwróconą-fazą i chromatografię-jonowymienną. Dzięki połączeniu ultrafiltracji i chromatografii sekwencyjnej mRNA osiąga wysoki poziom czystości.
Aby spełnić wymagania dotyczące formułowania lub przechowywania, roztwór podstawowy mRNA jest ponownie zatężany lub rozcieńczany przy użyciu kaset membranowych 30 kDa, 100 kDa lub 300 kDa lub kolumn z pustymi włóknami w celu precyzyjnego dostosowania docelowego stężenia i wymiany na końcowy bufor preparatu. Na koniec stosuje się sterylną-filtrację, aby kontrolować obciążenie mikrobiologiczne, kończąc tymczasowe przechowywanie i napełnianie materiału.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LM).
Oczyszczanie preparatów mRNA-LNP
Nanocząstki lipidowe (LNP) są obecnie najszerzej badanym systemem dostarczania leków mRNA. Obecnie różne preparaty mRNA-LNP znajdują się na różnych etapach rozwoju przedklinicznego i klinicznego. LNP są bardzo wrażliwe na procesy produkcyjne. Wśród operacji jednostkowych wymaganych do produkcji mRNA-LNP, znaczącym wyzwaniem są zatężanie i wymiana buforu poprzez filtrację z przepływem stycznym (TFF), a także filtrację sterylną. Etapy te muszą być starannie zoptymalizowane, aby zapewnić skalowalność procesu i jakość produktu, jednocześnie unikając problemów, takich jak zanieczyszczanie membrany i nieprawidłowe ładowanie filtra.
Po kapsułkowaniu mRNA do oczyszczania stosuje się filtrację z przepływem stycznym (TFF). Celem tego etapu jest usunięcie niekapsułkowanego mRNA, wolnych polimerów lub materiałów lipidowych, a także pozostałości rozpuszczalników z mRNA i lipidów. Ponieważ mRNA-LNP wykazują ograniczoną stabilność w temperaturze pokojowej, optymalizacja dalszych procesów, w tym TFF, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania jakości produktu.
Kluczowe kierunki optymalizacji obejmują: odpowiednie ustawienie ciśnienia transbłonowego (TMP) i stycznego natężenia przepływu w oparciu o rozmiar cząstek i stabilność mRNA-LNP w celu zrównoważenia wydajności filtracji i stresu cząstek; wybór membran lub kolumn z pustymi włóknami o odpowiednich-odcięciach masy cząsteczkowej (MWCO, np. 100 kDa lub 300 kDa), aby skutecznie usunąć wolne mRNA, zanieczyszczenia i bufor wymiany, minimalizując jednocześnie adsorpcję lub uszkodzenie cząstek; oraz optymalizację stężenia i objętości diafiltracji, aby zapewnić skuteczną wymianę buforu do docelowego preparatu i kontrolować końcowe stężenie i dyspersję cząstek.
Ponadto krytyczne atrybuty jakości (takie jak wielkość cząstek, wskaźnik polidyspersyjności [PDI] i skuteczność kapsułkowania mRNA) muszą być ściśle monitorowane podczas procesu, a parametry dynamicznie dostosowywane w oparciu o dane-czasu rzeczywistego, aby osiągnąć stabilne, skalowalne i wydajne oczyszczanie i formułowanie mRNA-LNP.
Ponadto, ze względu na niestabilność mRNA-LNP i ich składników w warunkach końcowej sterylizacji, do usuwania bakterii i innych zanieczyszczeń mikrobiologicznych zazwyczaj stosuje się sterylny filtr o średnicy 0,2 µm.
