Przemysłowy-dalszy proces oczyszczania na skalę przemysłową szczepionki przeciwko zakaźnemu zapaleniu nosa i tchawicy bydła (IBR) — sekcja „Ultrafiltracja”
Zakaźne zapalenie nosa i tchawicy bydła (IBR) jest spowodowane zakażeniem wirusem zakaźnego zapalenia nosa i tchawicy bydła (IBRV), znanym również jako herpeswirus bydła typu 1 (BHV-1). Choroba charakteryzuje się głównie objawami ze strony układu oddechowego i poronieniem. Oprócz tych objawów klinicznych IBR może prowadzić do zmniejszenia wydajności mlecznej u bydła mlecznego i zmniejszenia przyrostu masy ciała u bydła mięsnego, co powoduje znaczne straty ekonomiczne w gospodarstwach hodowlanych.
Choroba ma charakter immunosupresyjny. Gdy występuje jako pojedyncza infekcja, jej patogeniczność jest stosunkowo niska; jednakże w przypadku wystąpienia infekcji mieszanych z innymi chorobami wirusowymi lub bakteryjnymi, nasilenie i szkody znacznie wzrastają. Szczepienia są najskuteczniejszą metodą zapobiegania i kontroli. Dostępne są dwa główne typy szczepionek: szczepionki żywe, atenuowane i szczepionki inaktywowane. Obecnie stosowane w gospodarstwach szczepionki przeciwko zakaźnemu zapaleniu nosa i tchawicy bydła to głównie szczepionki inaktywowane.
Żywe, atenuowane szczepionki charakteryzują się silną immunogennością, szybkim pojawieniem się odporności i długim czasem trwania ochrony (zwykle ponad sześć miesięcy). Są one powszechnie stosowane do szczepień interwencyjnych podczas wybuchów chorób. Jednakże niosą ze sobą potencjalne ryzyko rozsiewania wirusa, stwarzają ryzyko dla ciężarnych krów i nie można ich stosować u bydła latentnie zakażonego, ale bezobjawowego.
Szczepionki inaktywowane charakteryzują się wysokim bezpieczeństwem, brakiem ryzyka rozsiewu wirusa lub powrotu do zjadliwości i są uważane za całkowicie bezpieczne. Można je stosować u bydła na każdym etapie rozwoju, w tym u krów ciężarnych, cieląt i buhajów hodowlanych. Jednakże początek odporności jest stosunkowo powolny, a czas trwania ochrony krótszy, dlatego zwykle wymagane są szczepienia przypominające. W niektórych przypadkach skuteczność ochronna może być słabsza niż w przypadku żywych atenuowanych szczepionek.
Niezależnie od tego, czy stosowana jest szczepionka żywa atenuowana, czy szczepionka inaktywowana, dalszy proces oczyszczania można podzielić na cztery główne etapy: zbiór i klarowanie → zatężanie i oczyszczanie wstępne → oczyszczanie doczyszczające → inaktywacja/sterylna filtracja i formułowanie.
Zatężanie jest kluczowym krokiem w dalszym procesie oczyszczania szczepionek, następującym bezpośrednio po klarowaniu. Jego głównym celem jest szybkie zredukowanie zebranego, dużej-objętości i niskim-stężeniu klarownego roztworu wirusa do postaci o małej-objętości i wysokim-stęeniu, przy jednoczesnym zachowaniu bioaktywności wirusa. Stwarza to warunki niezbędne do kolejnych etapów dokładnego oczyszczania o wysokiej-rozdzielczości, ale-o małej wydajności, takich jak chromatografia.
Ten etap jest zwykle przeprowadzany przy użyciu ultrafiltracji z przepływem stycznym (TFF). Zasada jest następująca: roztwór zasilający wirusa przepływa równolegle do powierzchni membrany ultrafiltracyjnej o określonej wielkości porów. Pod ciśnieniem małe cząsteczki, takie jak woda, sole i niektóre zanieczyszczenia, przechodzą prostopadle przez membranę i są usuwane, podczas gdy nienaruszone cząstki wirusa, które są znacznie większe niż pory membrany, są zatrzymywane, stale recyrkulowane i zagęszczane. W porównaniu z tradycyjnym wirowaniem-z dużą prędkością, metoda ta jest łagodniejsza w przypadku delikatnych wirusów, takich jak IBRV, które mają otoczkę lipidową. Skutecznie zmniejsza uszkodzenia strukturalne wirusa i utratę aktywności spowodowane dużymi siłami ścinającymi i jest bardziej podatny na skalowanie liniowe-w przypadku produkcji przemysłowej.
Skuteczna operacja zagęszczania to znacznie więcej niż tylko zmniejszenie objętości. Kluczowe punkty optymalizacji procesu obejmują: precyzyjną kontrolę ciśnienia transmembranowego i natężenia przepływu surowca w celu zrównoważenia wydajności filtracji przy jednoczesnej minimalizacji polaryzacji stężenia i zanieczyszczenia membrany; wybór odpowiedniego materiału membrany i rozmiaru porów, aby zapewnić wysoką retencję wirusów i przepływ permeatu; oraz znalezienie optymalnej równowagi pomiędzy odzyskiem wirusa, współczynnikiem stężenia i czasem przetwarzania. Stężona zawiesina wirusa nie tylko osiąga znacznie wyższe miano, ale także osiąga wstępne oczyszczenie poprzez usunięcie dużej części-rozpuszczalnych w wodzie zanieczyszczeń. Zapewnia to niezbędną podstawę objętości i stężenia dla kolejnych krytycznych etapów udoskonalania, takich jak chromatografia i obróbka nukleazami, czyniąc zatężanie centralnym węzłem wydajności w całym dalszym procesie.
Wtórna diafiltracja to krytyczny etap dalszego oczyszczania szczepionki, przeprowadzany po dokładnym oczyszczeniu i przed formułowaniem. Zwykle przeprowadza się je po chromatografii i obróbce nukleazą. Jego zasadniczym celem nie jest wstępne zatężanie, ale wymiana systemu i precyzyjne dostosowanie warunków końcowej receptury. Proces przeprowadza się w systemie ultrafiltracji z przepływem stycznym (TFF), w którym do krążącego stężonego roztworu wirusa w sposób ciągły dodaje się świeży, czysty bufor preparatu, usuwając jednocześnie pierwotny rozpuszczalnik i zanieczyszczenia-małocząsteczkowe. Ta operacja skutecznie i delikatnie eliminuje resztkowe sole, rozpuszczalniki organiczne, produkty degradacji nukleaz i śladowe rozpuszczalne zanieczyszczenia pozostałe po procesie oczyszczania.
Kluczem jest utrzymanie stałej objętości lub zastosowanie niewielkich korekt stężenia, aby mieć pewność, że stężenie wirusa odpowiada specyfikacjom preparatu. W przypadku delikatnych wirusów otoczkowych, takich jak wirus zakaźnego zapalenia nosa i tchawicy bydła (IBRV), delikatne środowisko hydrodynamiczne wtórnej diafiltracji ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności cząstek i immunogenności. Ostatecznie ten etap zapewnia solidną podstawę do późniejszej inaktywacji (jeśli jest to wymagane), dodania adiuwantu lub stabilizatora i końcowego napełniania, zapewniając, że produkt końcowy wejdzie do preparatu z określonymi składnikami, jednolitymi warunkami i dobrą kompatybilnością. Jest to zatem jeden z podstawowych kroków zapewniających bezpieczeństwo, stabilność i spójność poszczególnych partii szczepionki.
IBRV to wirus z otoczką,-liniowym DNA z otoczką w przybliżeniu kulistą. Dojrzałe cząstki IBRV mają średnicę około 160–230 nm. W związku z tym zastosowanie membran ultrafiltracyjnych 100, 300 lub 500 kDa może zatrzymać IBRV, jednocześnie usuwając niektóre zanieczyszczające białka. Stopień odzysku ultrafiltracji w kasetach membranowych Jiuling Technology różni się w zależności od rodzaju materiału wsadowego, ale zazwyczaj osiąga 90–95%.