Krótka dyskusja na temat kilku unikalnych metod oczyszczania pustych w środku włókien

Ciała inkluzyjne (IB) to nierozpuszczalne cząstki białka o dużej gęstości owinięte w błony powstałe w wyniku ekspresji obcych genów w komórkach prokariotycznych, szczególnie w Escherichia coli. Obserwowany pod mikroskopem IB jest obszarem o wysokim współczynniku załamania światła, który oczywiście różni się od innych składników cytoplazmy.

Tworzenie ciałek inkluzyjnych jest stosunkowo złożone, związane z szybkością wytwarzania białek w cytoplazmie, stężenie nowo wytworzonych peptydów jest wysokie i nie ma wystarczająco dużo czasu na zwinięcie, w wyniku czego powstają amorficzne agregaty białkowe. Ciała inkluzyjne składają się zasadniczo z białek, z których ponad 50% to produkty sklonowane. Podstawowa struktura tych produktów jest całkowicie poprawna, ale konfiguracja trójwymiarowa jest błędna, więc nie ma aktywności biologicznej. Wielkość ciałek inkluzyjnych wynosi 0,5-1 µm, są one nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczalne jedynie w środkach denaturujących, takich jak mocznik, chlorowodorek guanidyny itp.

U E. coli ciała inkluzyjne mogą występować w dwóch lokalizacjach komórki: cytoplazmie i cytoplazmie obwodowej. Lokalizacja i charakterystyka ciał inkluzyjnych w komórce zależy od sposobu ekspresji białek.

Inkluzje w cytoplazmie E. coli na ogół mają średnicę od {{0}},2 do 1,5 μm, a różne białka mają różną średnicę, np. wielkość interferonu wynosi 0,811 μm, a wielkość prorennet wynosi 1,281 μm. W niektórych przypadkach średnica niektórych ciałek inkluzyjnych jest większa niż średnica E. coli, co powoduje wypukłość E. coli. Ogólnie rzecz biorąc, komórka ma tylko jedno ciałko inkluzyjne.

 

Oczyszczanie ciała włączającego

 

Proces oczyszczania ciał inkluzyjnych jest ogólnie następujący:

Kruszenie komórek:

Ogólna technologia kruszenia komórek to: szybkie kruszenie tkanek, homogenizacja homogenizatora szklanego, obróbka ultradźwiękowa, metoda wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, obróbka chemiczna (zwykle przy użyciu obróbki lizozymem).

 

Włączenie mycia ciała:

Ciała inkluzyjne to nieaktywne cząstki stałe powstałe w wyniku wewnątrzkomórkowej aglutynacji białek wyrażanych przez bakterie, które zwykle występują w postaci amorficznej, nierozpuszczalnej. W ciałku inkluzyjnym prawdziwe białko docelowe stanowi tylko około 50%, a reszta zawiera lipidy, lipopolisacharydy, kwasy nukleinowe i heteroproteiny, które są związane z ciałkiem inkluzyjnym i wpływają na renaturację białka ciała inkluzyjnego. Dlatego mycie przed denaturacją jest bardzo niezbędnym krokiem.

Ponadto przemywanie ciał inkluzyjnych jest pomocne w zwiększeniu wydajności ponownego fałdowania rekombinowanych białek. Usuwając zanieczyszczenia, można zmniejszyć przeszkody w procesie renaturacji, dzięki czemu białko może być skuteczniej składane i prawidłowo składane, poprawiając w ten sposób aktywność i funkcję białka.

Do prania powszechnie stosuje się mniej niż 1% neutralnego detergentu, takiego jak Tween, Triton, Urea i NP40 plus EDTA i środki redukujące 2-merkaptotreitol (DTT), -merkaptoetanol powtarzane wiele razy, ponieważ skuteczność prania detergentu jest zwiększona dzięki w celu zwiększenia siły jonowej roztworu, do przemywania ciał inkluzyjnych można dodać NaCl w celu zwiększenia siły jonowej.

Ciała inkluzyjne można stosować do usuwania innych składników roztworu rozkładającego komórki przez wirowanie lub filtrację, przy czym w obu przypadkach wykorzystuje się różne właściwości fizyczne ciałek inkluzyjnych.

 

Wirowanie:

Białka ciał inkluzyjnych są znacznie gęstsze niż ta sama objętość fragmentów komórek, dlatego ciałka inkluzyjne można oddzielić od reszty komórki za pomocą wirowania. Wirowanie ciągłe jest najczęściej stosowaną operacją otrzymywania ciał inkluzyjnych w produkcji przemysłowej. Ponieważ gęstość fragmentów komórek jest mniejsza niż gęstość ciałek inkluzyjnych, szybkość sedymentacji jest mniejsza niż gęstość ciałek inkluzyjnych. Ciągłe zawieszanie i wirowanie umożliwia odwirowanie większości ciałek inkluzyjnych, podczas gdy fragmenty komórek są stopniowo usuwane.
Filtracja (filtracja z przepływem stycznym): Ze względu na różne rozmiary cząsteczek ciał inkluzyjnych i białek rozpuszczalnych, można zastosować metodę filtracji, która może obniżyć koszty operacyjne i ułatwić zwiększanie skali. Filtracja z przepływem stycznym (TFF) napędzana jest transmembranową różnicą ciśnień. Substancje i zanieczyszczenia mniejsze niż wielkość porów membrany przechodzą przez membranę, natomiast zanieczyszczenia takie jak komórki z większymi cząstkami są wychwytywane. Otwór membrany zwykle używany do płukania filtracji wynosi 0,1 μm. Mikrofiltracja z przepływem stycznym z pustymi włóknami może bezpośrednio poradzić sobie z dużą zawartością substancji stałych w ciekłym materiale, mniejszą liczbą etapów, prostą obsługą, membrana może być używana wielokrotnie poprzez czyszczenie, zmniejszając inwestycje w sprzęt i koszty operacyjne, zgodnie z wymogami modułowej zautomatyzowanej produkcji.

 

Poniżej przedstawiono przypadek zastosowania inkluzyjnego mycia karoserii przy użyciu kolumn Guidling z pustymi włóknami.

Użyliśmy pustych włókien o średnicy 94 cm2 0.1-0,45 μm, aby zatężyć 250 ml płynu (docelowa masa cząsteczkowa białka 17 kd). W całym procesie przemywania badano stopień odzysku białka docelowego oraz zmniejszenie przepływu błonowego.

0-71min to proces zatężania, 71-224min to proces mycia i filtracji. Podczas całego procesu mikrofiltracji TMP stopniowo wzrastało, prędkość na wlocie cieczy pozostawała niezmieniona, a średni strumień materiału wynosił 12LMH.

Wyniki wykazały, że docelowe białko zostało całkowicie uwięzione, a stopień jego odzysku wyniósł ponad 90%. Kolumny prowadzące z pustych włókien są stabilne i odpowiednie do tego zastosowania.

 

Rozpuszczanie ciałek inkluzyjnych:

Ciała inkluzyjne są na ogół rozpuszczane pod wpływem środka denaturującego – mocznika lub chlorowodorku guanidyny, a rozpuszczone białka ciał inkluzyjnych ulegają całkowitej denaturacji, to znaczy, z wyjątkiem zachowania struktury pierwszorzędowej i wiązań kowalencyjnych, wszystkie wiązania wodorowe i hydrofobowe ulegają zniszczeniu, a hydrofobowe łańcuchy boczne są całkowicie odsłonięte.

Mocznik i chlorowodorek guanidyny są środkami denaturującymi o średniej sile, które można łatwo usunąć poprzez dializę i ultrafiltrację. Ogólne stężenie mocznika 8-10M, chlorowodorku guanidyny 6-8M. Rozpuszczanie mocznika ma zalety braku jonizacji, neutralności, niskiego kosztu, usunięcie białka po renaturacji nie spowoduje dużej ilości wytrącania białka, a rozpuszczone ciała inkluzyjne można oczyścić różnymi metodami chromatograficznymi, dlatego jest szeroko stosowany .

 

Ponowne fałdowanie białek ciała inkluzyjnego:

Rozpuszczone, rekombinowane białko musi zostać prawidłowo zwinięte, aby utworzyć białko funkcjonalne. Techniki renaturacji obejmują rozcieńczanie roztworu białka do stanu prawie obojętnego, usuwanie środka denaturującego, renaturację na kolumnie i chromatografię przez filtrację żelową. Wśród nich rozcieńczanie roztworu białka do prawie neutralnego i usuwanie denaturatu jest powszechną klasyczną metodą renaturacji, szczególnie metoda renaturacji przez rozcieńczanie ma najwyższy stopień wykorzystania.

Usuwanie denaturatu:

Dializa: Zaletą jest to, że objętość nie zwiększa się, a szybkość usuwania denaturanta jest kontrolowana poprzez stopniowe zmniejszanie stężenia zewnętrznej przepuszczalnej cieczy, ale zajmuje dużo czasu i łatwo tworzą się nieaktywne agregaty białkowe, co nie jest odpowiednie dla działania na dużą skalę i nie można ich zastosować na skalę produkcyjną.

Ultrafiltracja (TFF): łatwa kontrola szybkości dializy, zarówno w badaniach i rozwoju, testach pilotażowych, jak i produkcji, może usuwać denaturanty (zmiana cieczy + stężenie) poprzez ultrafiltrację (TFF).

 

Oczyszczanie białek organizmu włączającego:

Metody oczyszczania białek po renaturacji są podobne do metod oczyszczania białek rozpuszczalnych, a mianowicie chromatografia jonowymienna, chromatografia z filtracją żelową, chromatografia powinowactwa, wytrącanie solą z siarczanu amonu itp.

Ciałka inkluzyjne nie wykazują aktywności biologicznej, nie ma potrzeby martwić się utratą aktywności białka, a duża ilość ekspresji nie doprowadzi do śmierci komórki i zmaksymalizuje odporność na atak proteazy. Puste włókno Jiuling można elastycznie stosować w dalszym procesie oczyszczania ciałek inkluzyjnych. Na etapie mycia korpusu wtrąceniowego, doskonała wydajność w porównaniu z myciem odśrodkowym, zastosowanie pustych włókien mikrofiltracyjnych w technologii dziewięcioletniej do mycia filtracyjnego z przepływem stycznym może znacznie skrócić czas procesu, a ogólny stopień odzysku może osiągnąć ponad 90%. Puste włókno Jiuling można również stosować na etapie renaturacji białek ciałek inkluzyjnych. Zmętnienie cieczy zasilającej filtrowanej przez puste włókna mikrofiltracyjne zostanie znacznie zmniejszone, a stopień odzysku białka jest wysoki; Zastosowanie pustych włókien ultrafiltracyjnych może nie tylko usunąć denaturanty, ale także skrócić czas ładowania próbki chromatograficznej, aby zaoszczędzić czas, zmniejszyć objętość wypełniacza i obniżyć koszty produkcji. Stopień odzysku pustych włókien mikrofiltracyjnych/ultrafiltracyjnych różni się w zależności od różnych materiałów, a ogólny współczynnik odzysku może osiągnąć 90-95%.

Guidling Technology zaprasza do zamawiania zestawów testowych w celu uzyskania powiązanych recenzji.

 

O Guidlingu

Guidling Technology to krajowe przedsiębiorstwo high-tech skupiające się na biofarmaceutykach, hodowlach komórkowych, oczyszczaniu i zatężaniu biomedycyny, diagnostyce i płynach przemysłowych. Z powodzeniem opracowaliśmy urządzenia do filtrów odśrodkowych, kasety do ultrafiltracji i mikrofiltracji, filtry wirusowe, systemy TFF, filtry wgłębne, włókna kanalikowe itp., które w pełni spełniają scenariusze zastosowań biofarmaceutyków, hodowli komórkowych i tak dalej. Nasze membrany i filtry membranowe są szeroko stosowane w zatężaniu, ekstrakcji i separacji przed filtracją wstępną, mikrofiltracją, ultrafiltracją i nanofiltracją. Nasze liczne linie produktów, od małych jednorazowych filtrów laboratoryjnych po produkcyjne systemy filtracji, badania sterylności, fermentacja, hodowle komórkowe i inne, spełniają potrzeby testowania i produkcji. Guidling Technology z niecierpliwością czeka na współpracę z Tobą!