Technologia membranowa i wyjaśnienie szczepionek (II)
W poprzednim artykule przedstawiliśmy wstępne wprowadzenie do szczepionek i strategii wyjaśniania szczepionek, a w dalszej części artykułu będziemy je dalej zgłębiać. Kontynuując powyższe, będziemy nadal dzielić się wyjaśnieniami dotyczącymi szczepionek i powiązanymi zastosowaniami w tkankach błonowych.
2.2.2 Wpływ właściwości fizycznych i chemicznych wirusa
Po rozważeniu systemu produkcji i metod usuwania odpowiednich zanieczyszczeń na etapie klarowania, ważne jest uwzględnienie charakterystyki wirusa i skupienie się na maksymalizacji wydajności wirusa.
2.2.2.1 Łatwa adsorpcja wirusa
Materiały o ładunku dodatnim i materiały pomocnicze do filtracji (takie jak diatomit) zostały opracowane w celu poprawy efektów głębokiej filtracji. Chociaż ładunek dodatni zwiększa wychwytywanie kwasów nukleinowych i HCP, wiadomo, że diatomit wiąże szczątki komórek i koloidy. Jednak materiały te mogą również zatrzymywać wirusa poprzez mechanizm adsorpcji. Ponieważ wirus jest zwykle naładowany ujemnie w roztworze, mogą wystąpić oddziaływania elektrostatyczne z filtrem o ładunku dodatnim.
Wirusy mogą również wiązać się poprzez swoje hydrofobowe lub niespecyficzne interakcje z pewnymi materiałami filtracyjnymi (takimi jak diatomit lub włókna szklane). Wirusy otoczone, ze względu na ich otoczkę lipidową, są bardziej podatne na tę adsorpcję. Jeśli wirus zostanie zaadsorbowany do filtra poprzez oddziaływania elektrostatyczne, a cząsteczki wirusa zostaną odłączone z powodu konkurencji soli, przepłukanie filtra wysoce przewodzącym buforem może częściowo odzyskać wirusa. Może to jednak również wymyć zanieczyszczenia, takie jak HCP lub kwasy nukleinowe. Dlatego też preferowane jest użycie alternatywnego materiału filtracyjnego, takiego jak bardziej obojętny polipropylen.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Wiadomo, że wirusy grypy są podatne na utratę adsorpcji podczas klarowania. Dlatego też użycie filtra bez opłat, filtra na bazie polipropylenu, nadaje się do klarowania zbioru wirusów grypy. Thompson i in. zgłosili użycie nominalnego filtra polipropylenowego 1,2 μ m, a następnie membrany PVDF 0.45 μm do klarowania wirusa grypy na bazie komórek wytwarzanego przez komórki MDCK. Przeprowadzono łącznie dziewięć testów oczyszczania w skali 20L, obciążając 111 L/m2 dla filtra polipropylenowego 1,2 μm i 105 L/m2 dla filtra PVDF 0,45 μm. Wyniki wykazały, że większość działających wirusów odzyskała się dobrze (78-154%). Zgłosili również do 58% usunięcia hcDNA, ale bez znaczącego usunięcia HCP.
2.2.2.2 Przycinanie wrażliwych wirusów
Niektóre wirusy (otoczone lub nieotoczone) wykazują niską odporność mechaniczną i mogą zostać zniszczone przez narażenie na ścinanie podczas wirowania i filtracji membranowej. Siły ścinające generowane podczas etapów oczyszczania obejmujących filtrację lub chromatografię mogą spowodować odpadnięcie otoczki wirusa, co wpłynie na zakaźność. W zależności od rozmiaru, grubości i geometrii kapsydu, kapsyd wirusa może być kruchy lub odwrotnie, odporny na wysokie ciśnienia. Niektóre wirusy otoczkowe, takie jak wirusy grypy, są elastyczne w stosunku do naprężeń mechanicznych i mogą wytrzymać duże odkształcenia. Z drugiej strony, siła ścinająca może spowodować odpadnięcie otoczki mniej odpornych wirusów, takich jak retrowirusy, co wpłynie na zakaźność wirusa.
Pozakomórkowe VLP otoczki są również bardzo podatne. Wysokie szybkości ścinania są generowane w procesie odśrodkowym, głównie w częściach wlotowych i wylotowych (wysokie szybkości ścinania są generowane na granicy gaz-ciecz). Gdy wirus został oczyszczony przez wirowanie gradientowe, zdolność transdukcji niektórych retrowirusów została znacznie osłabiona. Podczas projektowania separacji odśrodkowej należy wziąć pod uwagę względną niestabilność cząstek wirusa w stosunku do sił ścinających. Siła odśrodkowa nie jest jedynym źródłem wstrząsu ścinającego, ważniejsza jest konstrukcja sprzętu, zwłaszcza w imporcie i eksporcie, które również mają znaczny wstrząs ścinający. Różnice w konstrukcji różnych skal mogą prowadzić do różnic w wydajności i odzysku wirusów wrażliwych na ścinanie w różnych skalach.
Wirusy wrażliwe na ścinanie powinny być starannie zaprojektowane, ponieważ wielkość naprężenia ścinającego i czas narażenia na naprężenie (z powodu recyrkulacji) mogą być wysokie. W przypadku wirusów wrażliwych na ścinanie preferowane są urządzenia z otwartym obwodem (włókna puste lub urządzenia z otwartą płytą), aby zmniejszyć turbulencje i siły ścinające w kanale zasilającym.
Wybór parametrów operacyjnych powinien również minimalizować uszkodzenia cząsteczek wirusa: niski przepływ krzyżowy, średnie ciśnienie transbłonowe (TMP) i krótki czas przetwarzania.
Zanieczyszczenie błony pod wysokim ciśnieniem prowadzi do utraty zakaźności wirusa, prawdopodobnie z powodu sił, jakie działanie ścinające może oddziaływać na otoczkę wirusa. Separacja oparta na błonie opiera się na rozmiarze, a akumulacja inhibitorów wirusowych o dużej masie cząsteczkowej i cząstek wirusowych może zmniejszyć zakaźność wektorów wirusowych.
Degradacja wirusów wrażliwych na ścinanie podczas głębokiej filtracji nie jest szeroko udokumentowana. Utrata wirusów podczas głębokiej filtracji jest najczęściej przypisywana wychwytywaniu, adsorpcji lub zależnej od czasu i temperatury degradacji wirusowej produktu. W rzeczywistości, chociaż w systemach NFF może występować naprężenie mechaniczne, czas ekspozycji produktów NFF na ścinanie jest bardzo krótki w porównaniu z innymi technologiami ze względu na szybki pojedynczy przebieg występujący w produktach NFF.
2.2.2.3 Przechwytywanie według rozmiaru apertury
Wirusy powyżej 100 nm mogą zostać zatrzymane przez usunięcie mykoplazmy lub membran klasy sterylnej (0.22 μm i poniżej). W takim przypadku należy zwrócić szczególną uwagę na dobór filtrów. W przypadku etapów mikrofiltracji TFF, membrany 0.45μm lub 0,65μm są preferowane dla dobrych kanałów produktu. W przypadku wieloetapowej filtracji NFF, najgęstsza warstwa jest większa lub równa 0,45μm. Należy zachować ostrożność przy wyborze głębokiego filtra, ponieważ niektóre urządzenia do głębokiego filtrowania mogą zawierać warstwę folii, co może skutkować utratą produktu z powodu napędu retencyjnego. Agregacja wirusów negatywnie wpływa na produkcję wirusów i zwiększa retencję wirusów ze względu na ich rozmiar.
Według patentu Andre i Champluviera homogenizacja może zapobiegać lub ograniczać zatykanie filtrów poprzez zmniejszenie wielkości agregatu, zapewniając wyższą wydajność. Homogenizacja poprawiła również zdolność filtracji zbiorów, która wzrosła 2,4-3 razy.
Zbyt duża ilość zanieczyszczeń może zakłócać odzyskiwanie wirusa. Zanieczyszczenia mają tendencję do zatykania filtra, a zatkane pory membrany mogą powodować zmniejszenie szybkości przenikania wirusa. W patencie de Vochta i Veenstry wspomniano, że bezpośrednie klarowanie dużej gęstości komórek Per. Collection z TFF ({{0}}.65 lub 0.2 μm membrana) skutkowało odzyskiwaniem wirusa bez adenowirusów. Odzyskiwanie można osiągnąć poprzez selektywne usuwanie precypitacji DNA komórek gospodarza przed etapem TFF 0,65 μm. 70% adenowirusów.
2.3 Studium przypadku: Optymalizacja wyjaśnienia szczepionki wirusowej
Podczas Międzynarodowej Konferencji Procesów Biologicznych w 2011 r. firma Sanofi Pasteur przedstawiła racjonalne podejście do przesiewania filtrów w celu opracowania nowych klarownych sekwencji dla kandydatów na szczepionki wirusowe. Badania mają na celu przezwyciężenie problemów napotykanych przy optymalizacji procesów hodowli komórek i wirusów. Modyfikacje procesu wstępnego spowodowały 20% utratę wydajności i przedwczesne zanieczyszczenie filtra podczas etapu klarowania, co nie doprowadziło do zwiększenia skali. Aby ustanowić solidny i skalowalny etap klarowania, konieczne było całkowite ponowne opracowanie sekwencji filtra, przy czym wskaźniki odzysku wirusa były wyższe niż 85%.
Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Stopień odzysku filtrów z estru celulozowego i włókna szklanego zależy od oceny filtra (20% lub 90%).
W drugim kroku Sanofi Pasteur oceniło kilka kombinacji (sekwencje fazy 2 lub fazy 3) siedmiu filtrów wstępnie wybranych w badaniu przesiewowym. Test klasyfikacji stałego przepływu przeprowadzono przy użyciu małego filtra. Ponadto w tym eksperymencie zastosowano wyższą wydajność niż w badaniu przesiewowym. Na podstawie wyników odzyskiwania wirusów i pojemności filtra zespół wybrał dwie najlepsze kombinacje do dalszych badań.
- Sekwencja 1 (etap 2): nominalny filtr wstępny z polipropylenu o wielkości 30 μm, a następnie wielowarstwowy filtr z kompozytu estru celulozy i włókna szklanego (porowatość 1/0,5 μm)
- Sekwencja 2 (etap 3): ten sam filtr wstępny (filtr polipropylenowy o nominalnej wielkości 30 μm), następnie pośredni filtr wielowarstwowy z polipropylenu i na końcu asymetryczna folia z polieterosulfonu.
The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), jak pokazano na rysunku 1.
Rysunek 1 Średni odzysk wirusa na każdym etapie filtrowania. Badania stabilności zostały ocenione dla trzech sekwencji filtracji, z których tylko sekwencja 1 z użyciem nominalnego 30 μm składanego polipropylenu i 1.0/0,5 μm filtra z estru celulozy i włókna szklanego spełniła globalny cel odzysku.
Wirowanie zostało również ocenione jako podstawowy etap klarowania, po którym nastąpiła ostateczna filtracja {{0}}.45 μm. Przetestowano kilka par prędkość/czas trwania. Chociaż szybkość filtracji 0,45 μm została zwiększona dwukrotnie, ostateczna wydajność była niższa od docelowej 85%. W rezultacie wirowanie nie było dalej badane.
Na koniec oceniono wydajność sekwencji filtracji z polipropylenu i włókna szklanego na większą skalę (rozmiar bioreaktora 160 L). Sekwencję filtrów pokazano na rysunku 2.
Rysunek 2 wyjaśnia kombinację filtrów i graficzną reprezentację wydajności kroku ciągu. Pociąg A to proces tradycyjny, a pociąg B to proces zoptymalizowany. Zoptymalizowana sekwencja B może zmniejszyć obszar wstępnej filtracji o 3 razy, anulować pośredni etap filtracji i zmniejszyć obszar końcowej filtracji o 10 razy, zwiększając w ten sposób globalny odzysk wirusa o 3%.
Kilka partii zostało pomyślnie sklarowanych bez oznak zatkania filtra, czas procesu był zgodny z limitami produkcyjnymi, a wydajność wirusa > osiemdziesięciu pięciu procent. Optymalizacja etapu klarowania nie miała wpływu na dalsze etapy i kluczowe atrybuty jakościowe szczepionki. Dlatego wybrana sekwencja klarowania została użyta w procesie produkcji szczepionki (bioreaktor o pojemności 1000 l), a wydajność została pomyślnie potwierdzona.
03 Wyjaśnienie szczepionek bakteryjnych
3.1 Rozważania dotyczące wyjaśnienia szczepionek bakteryjnych
Według Medical Thesaurus (2015) szczepionka bakteryjna jest zdefiniowana jako zawiesina rozcieńczonych lub zabitych bakterii lub ich antygenowych pochodnych, która jest stosowana w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej w celu zapobiegania lub leczenia chorób bakteryjnych. Bardziej ogólnie, szczepionki bakteryjne można podzielić na cztery podkategorie w oparciu o rodzaj aktywnego antygenu. Tym czynnikiem może być:
- Zabija lub osłabia całe żywe bakterie. Znana również jako szczepionka BCG.
- Oczyszczanie determinantów antygenowych (szczepionki podjednostkowe). Szczepionka przeciw wąglikowi lub bezkomórkowa szczepionka przeciw krztuścowi.
- Toksyny bakteryjne (toksoidy). Toksoidy błonicze i tężcowe.
- Plazmid (pDNA).
Ze względu na dużą heterogeniczność produktów rodziny, wyzwania w procesie upstream i downstream zależą w dużej mierze od rodzaju produkowanej szczepionki. Dlatego po początkowym etapie fermentacji można ją oczyścić lub nie, aby można było przeprowadzić etap klarowania.
3.2 Strategia wyjaśniania szczepionek bakteryjnych
3.2.1 Toksoid
Dwa najczęstsze toksoidy produkowane do stosowania w szczepionkach to błonica i tężec, które są wytwarzane odpowiednio przez Corynebacterium diphtheriae i Clostridium tetani. Produkcja obu szczepionek podlega ścisłym wymogom regulacyjnym. Raport techniczny WHO i jego załączniki zawierają jasne zalecenia mające na celu zapewnienie jakości, bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek przeciwko tężcowi i błonicy. Ogólne Dobre Praktyki Wytwarzania mają zastosowanie do produkcji obu szczepionek, a pracownicy muszą być odpowiednio przeszkoleni i otrzymać szczepionkę przypominającą przeciwko obu chorobom.
GMP ściśle wymaga, aby czystość i jakość produktu końcowego zostały wykazane. Według WHO i EP skuteczność ostatecznej szczepionki przeciw tężcowi musi zostać określona poprzez porównanie in vivo lub z dowolną inną sprawdzoną metodą z odpowiednią substancją odniesienia skalibrowaną w jednostkach międzynarodowych zgodnie z Międzynarodową Normą dla toksoidu tężcowego. Zaktualizowane wymagania dotyczące skuteczności zostały opublikowane w 2011 r. i mogą się różnić w zależności od metody oceny. Należy również wykazać bezpieczeństwo (toksyczność wolna od toksyn i toksyczność naprawcza) każdej partii szczepionki. Na koniec należy zająć się stabilnością szczepionek, zwłaszcza w czasie rzeczywistym.
3.2.2 Szczepionka na bazie DNA plazmidowego
Szczepionki z plazmidowego DNA są stosowane w celach zdrowotnych dla zwierząt, a kilka szczepionek z plazmidowego DNA do stosowania u ludzi znajduje się na różnych etapach rozwoju i oceny klinicznej. Po fermentacji E. coli bakterie są zbierane i rozszczepiane w celu uwolnienia plazmidowego DNA.
Usuwanie resztek komórek odbywa się zazwyczaj poprzez wirowanie lub filtrację. Temat ten został szeroko omówiony w ostatnich publikacjach. W tej publikacji omówiono obecne procesy i wyzwania w górnym i dolnym biegu pDNA oraz formulację.
Autorzy przedstawiają również informacje na temat luk na każdym etapie typowego procesu produkcji pDNA oraz potencjalne przyszłe innowacje i/lub obecne luki technologiczne, które mogą doprowadzić do dalszej optymalizacji procesu.
Szczepionki DNA plazmidowego są przygotowywane w dwóch etapach. Najpierw komórki bakteryjne są usuwane z pożywki hodowlanej, a następnie usuwane są resztki komórek po lizie komórek. W zależności od skali komórki są zbierane za pomocą wirowania lub mikrofiltracji TFF. Wirówka talerzowo-prętowa jest wyrzucana okresowo z dużą prędkością, a wydajność superskręconych plazmidów jest niska z powodu uszkodzeń ścinających podczas rozładowywania. Jeśli konieczne jest użycie wirowania, najlepsza jest wirówka z pełną misą. Otwarte kanałowe, płaskie urządzenia TFF z membranami mikrofiltracyjnymi 0.1 lub 0.2 μm lub urządzenia z włóknami pustymi mogą dobrze działać.
Ponieważ urządzenia z włóknami pustymi mają wysoką nośność stałą, czasami są one traktowane priorytetowo. Zazwyczaj te procesy działają przy 3-5-krotności stężenia, po czym następują 3-5 objętości transfiltracji. Aby zmniejszyć ścinanie i lepiej kontrolować polaryzację membrany, zdecydowanie zalecane są operacje kontroli penetracji. Chociaż wirówki są bardziej opłacalne w przypadku operacji komercyjnych na dużą skalę, procesy na mniejszą skalę mają tendencję do stosowania filtracji ze względu na przenośność i łatwość obsługi.
Flokulanty były używane w celu ułatwienia przetwarzania, ale mogą prowadzić do utraty produktu. Niektórzy zalecają również stosowanie obojętnych cząstek ziemi okrzemkowej, a następnie filtrację workową.
Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>Filtry membranowe 0.45m) dobrze usuwają zanieczyszczenia komórkowe. Ze względu na silne zatykanie resztek komórkowych preferowana jest filtracja o niskim przepływie lub niskim ciśnieniu. Na tym etapie stosowano mikrofiltry na bazie Tff oraz filtry workowe na skalę przemysłową. Kraking statyczny (w naczyniu mieszającym) i ciągły (z wykorzystaniem liniowego mieszalnika statycznego) wymaga różnych filtrów.
3.3 Studium przypadku: Porównanie skuteczności wirowania, metod NFF i TFF w celu oczyszczenia toksyn tężcowych
Muniandi i in. porównali trzy różne metody klarowania toksyn tężcowych i toksoidów z płynów fermentacyjnych, a mianowicie wirowanie, głęboką filtrację (NFF) i TFF. Materiał testowy wytworzono w fermentorze 400L przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Millera (MMM). W badaniu wirowania komórki oddzielono od serca przy 4000 obr./min w pojemniku 6 × 1L przez 60 min. Pobrano próbki supernatantu w celu wykrycia odzysku toksoidów. Głęboka filtracja wykorzystuje głębokie filtry 0,45 μm i 0,22 μm zawierające ziemię okrzemkową i celulozę w celu klarowania bulionu fermentacyjnego. Proces przeprowadza się w temperaturze 35 stopni i ciśnieniu 12 psi.
Otwarty płaski panel modułu TFF jest termicznie połączony z membraną PVDF 0.22μm w metodzie TFF. Proces klarowania oparty na TFF został przeprowadzony przy przepływie krzyżowym 2000 l/h w temperaturze 23 stopni, a klarowany filtrat został zagęszczony przy przepływie krzyżowym 1000 l/h w temperaturze 25 stopni przy użyciu konwencjonalnej membrany TFF typu sandwich 30kD PES. Klarowany płyn mięsny (około 6 l) jest zagęszczany 10-krotnie w tym procesie ultrafiltracji. Testy toksoidu tężcowego zostały przeprowadzone na zagęszczonych próbkach retencyjnych w celu oceny odzysku produktu.
Głęboka filtracja spowodowała odzysk produktu na poziomie około 89%, a jednostki TFF spowodowały odzysk produktu na poziomie ponad 97%. Procesy mikrofiltracji i ultrafiltracji konsekwentnie przynoszą wyższe odzyski produktu niż proces NFF. Wyniki te opierają się na testach flokulacji (Lf).
04Wyjaśnienie szczepionek polisacharydowych
4.1 Rozważenie wyjaśnienia szczepionki polisacharydowej
Proces produkcji zarówno niesprzężonych/wolnych szczepionek polisacharydowych, jak i sprzężonych szczepionek polisacharydowych rozpoczyna się od hodowli bakterii gospodarza w fermentorze. Pod koniec fermentacji bakterie można poddać działaniu środków czyszczących, takich jak DOC (deoksycholan sodu), Triton®X-100 lub innych odpowiednich odczynników, aby zniszczyć bakterie i promować uwalnianie polisacharydów. Ze względu na dużą pojemność baterii, zbieranie bezpośrednio przez NFF nie jest ekonomicznie wykonalne, ponieważ przepustowość może być bardzo niska. Dlatego idealnym wyborem jest użycie wirówki do oddzielenia grudek komórek. Można również użyć zakresu mikrofiltracji TFF. Bezkomórkowe centrum/penetrant zawierające interesujący polisacharyd jest dalej klarowane przez system głębokiej filtracji NFF, a następnie filtracji biobattered, a następnie przechodzi do dalszego oczyszczania w celu dalszego oczyszczenia.
4.2 Strategia wyjaśniania szczepionek polisacharydowych
4.2.1 Pierwsza procedura wyjaśniająca
Wirowanie jest jedną z najpopularniejszych technik oddzielania komórek od płynów fermentacyjnych. W zależności od skali można wybrać ciągłe wirowanie lub wirowanie partiowe. Ważne jest, aby pamiętać, że prawidłowa optymalizacja warunków wirowania i ich działanie ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego oczyszczania w dół strumienia. Wybierając konkretną membranę TFF i rozmiar porów, ważne jest, aby pamiętać o masie cząsteczkowej polisacharydów, które są często duże i strukturalnie złożone, o masie cząsteczkowej od około 500kDa do ponad 1000kDa. Ze względu na duży rozmiar otwartych porów, użycie membran MF o średnicy 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm może zapewnić pomyślne odzyskiwanie cząsteczek PS w roztworze osmotycznym.
4.2.2 Procedura wyjaśnienia wtórnego
Klarowność/zmętnienie roztworu fermentacji bezkomórkowej, który dociera do etapu klarowania wtórnego, zależy od konkretnych bakterii, typu rozszczepienia, indywidualnego typu surowicy i techniki użytej w etapie klarowania pierwotnego. Zmętnienie środka może wynosić od około 50 do 150 NTU. Do klarowania i zmniejszania zmętnienia do < 5 NTU można użyć głębokiego filtra o ułamkowej gęstości naładowanego dodatnio, wykonanego z impregnowanej diatomitu z wypełnionymi włóknami celulozowymi.
Przepustowość objętościowa tego głębokiego filtra może wynosić od około 150 L/m3 do 250 L/m3. Zazwyczaj klarowny roztwór produktu jest filtrowany przez kolejną membranę o stopniu redukcji bio-wspieranej o średnicy porów 0,45 μm lub membranę o stopniu sterylizacji o średnicy porów 0,22 μm w celu usunięcia wszelkich pozostałych cząstek komórek, koloidów i potencjalnych mikroorganizmów.
4.3 Studium przypadku: Klarowanie centrum fermentacyjnego bulionu Streptococcus pneumoniae po wirowaniu
Komórki rozdzielono przez dodanie {{0}}.1% (v/v) bulionu fermentacyjnego Streptococcus pneumoniae typu 8 (20 L) przez ciągłe wirowanie. Centrum kolekcji filtrowano przez dwa oddzielne dodatnio naładowane i głębokie filtry z ziemią okrzemkową zawierające włókna celulozowe. Następnie indywidualny filtrat głębokiego filtra filtrowano przez membranę PVDF o stopniu redukcji bioobciążenia 0,45 μm. Wszystkie testy filtracji przeprowadzono w trybie stałego przepływu za pomocą pomp perystaltycznych. Testy filtracji przy użyciu naładowanego głębokiego filtra i bulionu fermentacyjnego Streptococcus pneumoniae serotypu 8 skutkowały spadkiem mętności z około 120 NTU do 3 NTU. Testy przeprowadzono przy przepływie 140 150 L/m2/godz. i różnicy ciśnień końcowych 20-25 psi, przy objętościowej przepustowości około 180-200 L/m2.
Podobne testy filtracji przeprowadzono na bulionie fermentacyjnym Streptococcus pneumoniae serotypu 19A. Odwirowany płyn 19A jest klarowany przez naładowany głęboki filtr, który zmniejsza mętność z około 40 NTU do 3 NTU. Testy przeprowadzono przy stałej szybkości przepływu około 140-160 L/m2/godz., a przepustowość objętościowa 200-230L/m2 została osiągnięta przy ciśnieniu końcowym około 15 psid. Analiza HLPC próbek produktu pobranych podczas testów oceny filtracji nie wykazała znaczącej utraty wydajności dla głębokiej filtracji lub membran 0.45 μm (lub 0,22 μm).
05 Wniosek
Rozwój procesów klarowania wymaga integracji kilku procesów jednostkowych, takich jak wirowanie, TFF-MF, głęboka filtracja i filtracja aseptyczna. Optymalizacja procesu klarowania wymaga zrozumienia, w jaki sposób różne operacje jednostkowe wpływają na siebie nawzajem. Wyzwaniem jest wybór technologii i narzędzi (sprzętu i osprzętu), aby sprostać coraz bardziej złożonym wymaganiom płynów procesowych wytwarzanych przez dzisiejsze bardziej wydajne bioreaktory. Wzrost produktywności w górnym biegu rzeki (mian wirusa, gęstość komórek itp.), szczątków komórek i produktów lizy komórek zwiększa trudność procesu klarowania i utrudnia wybór sprzętu do separacji i filtracji.
Przy wyborze skali procesu należy wziąć pod uwagę konstrukcję sprzętu, łatwość użytkowania i czystość. Zapewni to wydajną konwersję i bezpieczeństwo operatora podczas obsługi wyrzuconych filtrów. Aby opracować proces klarowania, ważne jest silne zintegrowanie etapów klarowania, aby zapewnić opłacalność przetwarzania zbiorów w górnym biegu rzeki. Dostępny jest szereg jednostek filtracyjnych, które ułatwiają testy laboratoryjne, produkcję pilotażową i przetwarzanie w pełnym rozmiarze. Wdrażając dobrze zaprojektowany plan pracy w zakresie skalowania, który ocenia wiele opcji klarowania, można pewnie wybierać i dobierać filtry klarujące, aby chronić operacje jednostek w dolnym biegu rzeki, jednocześnie zmniejszając koszty operacyjne.
Klarowanie szczepionek wiąże się z kilkoma wyzwaniami. Zazwyczaj proces filtracji musi być dostosowany do systemu produkcyjnego, środka inaktywującego lub lizującego oraz prezentacji antygenu, a niekoniecznie szczepionek. Tradycyjne procesy szczepionkowe zazwyczaj wykorzystują wirowanie do początkowego klarowania szczepionki. Nowoczesne szczepionki z wieloma platformami technologicznymi i mniejszymi objętościami przetwarzania sprawiają, że szczepionki są bardziej odpowiednie do klarowania za pomocą technologii opartych na błonach. Nowo opracowane szczepionki wykorzystujące nowoczesne linie komórkowe i systemy ekspresji oraz wykorzystujące bardziej zdefiniowane warunki hodowli komórkowej sprawiają, że wiele procesów szczepionkowych jest bardziej sprzyjających filtracji.
Jednak heterogeniczność składnika antygenowego lub „antygenu docelowego” produktów szczepionkowych zwiększa złożoność klarowania filtracyjnego. Antygeny różnią się rozmiarem, chemią powierzchni i ładunkiem. Te cechy wpływają na wydajność i odzysk antygenów. Szczepionki stwarzają wyjątkowe wyzwania w zakresie klarowania, głównie ze względu na rozmiar ich makrocząsteczek. To, w połączeniu z problemami dotyczącymi możliwości klarowania, zwiększa potrzebę wskazówek dotyczących strategii rozwoju procesu.
Wielkość i skala działalności na skalę komercyjną w zakresie produkcji szczepionek mają znaczący wpływ na wybór technologii klarowania. Będąc zlokalizowanym przed procesem, właściwa optymalizacja klarowania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia operacji jednostkowych w dół rzeki, maksymalizując wydajność, odzysk i solidność procesu. Podczas gdy wirowanie pozostaje realną opcją techniczną dla pierwotnego klarowania, jednostki mikrofiltracji kanałowej otwartej (TFF) do pierwotnego klarowania i drobne głębokie filtry lub filtry membranowe do wtórnego klarowania zyskują akceptację w branży szczepionek. Zmiana ta jest spowodowana potrzebą szybszego przetwarzania, szybkiego rozwoju procesu, przenośnych procesów i jednorazowych wdrożeń. NFF oferuje ekonomiczny proces odpowiedni dla małych i dużych opcji jednorazowego użytku. Ze względu na zmieniające się potrzeby regulacyjne dostępność urządzeń lub modułów preaseptycznych do napromieniowania promieniami gamma zaprojektowanych do autoklawowania promuje szybszą adaptację technologii opartych na NFF lub TFF.
Wiele klasycznych procesów szczepionkowych obejmuje ewolucję operacji jednostek klarujących, głównie z powodu ograniczeń regulacyjnych i związanych z tym wysokich kosztów ponownej walidacji i ponownego składania wniosków lub badań klinicznych. Proces platformowy wykorzystujący schemat klarowania oparty na filtracji był szeroko stosowany w przypadku kilku czynników biologicznych z dużym powodzeniem. Przykłady i przypadki opisane w tym dokumencie pokazują, że producenci szczepionek mają potencjał, aby osiągnąć ten poziom stabilności, opłacalności ekonomicznej i użyteczności jednorazowego użytku, postępując zgodnie z podejściem szablonowym.
Inne zalety filtracji w porównaniu z wirowaniem to wirusy wrażliwe na ścinanie lub wirusy, które mają tendencję do gromadzenia się na granicy powietrza. W miarę jak producenci urządzeń wprowadzają na rynek nowe produkty, producenci szczepionek będą nadal lepiej przygotowani do procesu klarowania.
Jako pierwsza firma w obwodzie lokalizacji, Guidling Technology zgromadziła wystarczające doświadczenie w zakresie klarowania szczepionek. Guidling Technology to firma zajmująca się rozwojem i produkcją, skupiająca się na biofarmaceutyce i hodowli komórkowej, oczyszczaniu i separacji. Produkty są szeroko stosowane w biomedycynie, diagnostyce, filtracji płynów przemysłowych, wykrywaniu, klarowaniu, oczyszczaniu i procesach koncentracji; Guidling pomyślnie opracował probówkę wirówki ultrafiltracyjnej, kasetę membranową ultrafiltracji/mikrofiltracji, filtr do usuwania wirusów, urządzenie filtrujące o przepływie stycznym, głęboki stos membran itp., które w pełni spełniają scenariusze zastosowań biofarmaceutyki i hodowli komórkowej.
Nasze membrany i filtry membranowe są szeroko stosowane w koncentracji, ekstrakcji i separacji wstępnej filtracji, mikrofiltracji, ultrafiltracji i nanofiltracji. Nasza szeroka gama linii produktów, od małych jednorazowych laboratoryjnych systemów filtracyjnych po systemy filtracji typu produkcyjnego, testy sterylności, fermentację, hodowlę komórkową i wiele innych, może sprostać potrzebom testowania i produkcji.