Jaki jest wpływ stężenia paszy na kasety ultrafiltracyjne?

Kiedy na początku swojej kariery jako dostawca filtrów zaczynałem pracę z kasetami do ultrafiltracji (UF), przyznaję, że nie zastanawiałem się zbytnio nad stężeniem paszy poza sprawdzeniem, czy przetwarzany przeze mnie roztwór jest „wystarczająco gęsty”. To się szybko zmieniło — kiedy klient biotechnologiczny uderzył w barierę swoim krokiem w zakresie stężenia przeciwciał, obwiniając częste zatykanie i dziwnie niespójne szybkości przepływu. Okazało się, że naciskali znacznie więcej, niż była w stanie udźwignąć ich kaseta UF, co kosztowało ich dni przestojów i partię drogiego produktu. Jeśli pracujesz z kasetami UF, nie jest to tylko drobny szczegół — to jedna z najważniejszych dźwigni wpływających na przebieg procesu lub jego przerwania, od wydajności po czas pracy. Przyjrzyjmy się, jak koncentracja paszy wpływa na każdą część UF i czego nauczyłem się przez lata, aby wszystko działało sprawnie.

Najpierw oprzyjmy to na tym, co faktycznie robią kasety UF, żeby mieć pewność, że jesteśmy na tej samej stronie. Jeśli dopiero zaczynasz przygodę z tą grą, kaseta UF to samodzielna jednostka z płaskimi membranami (sprawdź naszePłaska kasetastrona z pełnym rozkładem), który oddziela cząsteczki według wielkości — małe cząstki przechodzą przez membranę, podczas gdy większe są „zatrzymywane” i koncentrowane po stronie zasilania. Co sprawia, że ​​są tak popularne w biofarmaceutyce, żywności i napojach oraz ściekach? Są kompaktowe, nadają się do wielokrotnego użytku (czasami, jeśli zostaną odpowiednio wyczyszczone) i znacznie bardziej spójne niż starsze, ręcznie wycinane konfiguracje membran. TheUltrafiltracja kasetowaLinia, którą oferujemy, jest zbudowana z myślą o skalowalnych seriach, od małych partii laboratoryjnych po pełną produkcję, dlatego współpracowaliśmy z klientami, od start-upów biotechnologicznych po globalne marki spożywcze.

Stężenie w paszy, dla tych, którzy nie zagłębili się w terminologię, to w zasadzie ilość docelowej (lub niepożądanej) substancji rozpuszczonej w roztworze, który pompujesz do kasety. Na przykład, jeśli zatężasz przeciwciała monoklonalne (mAb) z bulionu do hodowli komórkowej, stężenie w paszy oznacza, ile gramów mAb przypada na litr tego bulionu. Nie chodzi tylko o cel — domieszkowane są w nim także zanieczyszczenia, takie jak resztki komórek, składniki pożywki i resztki soli buforowych. Najlepszy punkt koncentracji paszy różni się w zależności od wartości odcięcia masy cząsteczkowej membrany (MWCO), prawda? Kaseta UF 30 KD doskonale sprawdza się w przypadku małych białek, natomiast kaseta 500 KD jest przeznaczona w przypadku większych cząsteczek, takich jak wektory wirusowe. Widziałem, jak klienci łapali pierwszą kasetę, na którą spojrzeli, niezależnie od stężenia paszy, i tu zaczynają się błędy.

Zacznijmy od najbardziej bezpośredniego skutku: szybkości strumienia. Strumień to objętość roztworu przechodząca przez membranę na jednostkę powierzchni na godzinę — to podstawa produktywności UF. Kiedy stężenie paszy jest zbyt wysokie, strumień spada szybko, a nie liniowo. Oto dlaczego: podczas przetwarzania roztworu zatrzymane substancje rozpuszczone gromadzą się w pobliżu powierzchni membrany, tworząc tak zwaną „warstwę polaryzacyjną stężenia”. Warstwa ta działa jak dodatkowa bariera, więc woda i małe substancje rozpuszczone muszą pracować ciężej, aby się przedostać. Jeśli na początku stężenie surowca jest bardzo wysokie, warstwa polaryzacyjna szybko staje się gęsta i wkrótce ledwo przepycha się przez nią permeat. W zeszłym roku miałem klienta, który korzystał z kasety ultrafiltracyjnej 30 KD na gęstym supernatancie hodowli komórkowej — podawał białko w dawce 25 g/l, podczas gdy nasze zalecenie wynosiło 10–15 g/l. Ich strumień spadł z 60 l/m²/h do 12 l/m²/h w ciągu 2 godzin i musieli przedwcześnie wyłączyć urządzenie, aby wyczyścić kasetę, marnując 12 godzin pracy. Co gorsza, polaryzacja w wysokim stężeniu doprowadziła do utknięcia niektórych białek w tej warstwie, przez co ich wydajność była o 18% niższa niż oczekiwano.

Ale nie chodzi tylko o strumień — koncentracja surowca jest również bezpośrednio powiązana z zanieczyszczaniem membran, które jest wielkim straszydłem UF. Zanieczyszczanie ma miejsce, gdy substancje rozpuszczone, zanieczyszczenia lub agregaty przyklejają się trwale do powierzchni membrany lub ścianek porów, a sytuacja jest znacznie gorsza w przypadku nadmiernie skoncentrowanych surowców. Kiedy substancje rozpuszczone są stłoczone razem w paszy, istnieje większe prawdopodobieństwo, że zderzą się z membraną i zostaną uwięzione. Na przestrzeni lat wyczyściłem setki kaset UF i w 80% przypadków ślady silnych zanieczyszczeń powodują, że stężenie paszy jest 2–3 razy większe niż zalecany zakres. Na przykład klient zajmujący się żywnością przetwarzający sok owocowy chciał zagęścić do 30° Brix w jednym przejściu, zamiast 15° Brix (co jest najlepszym rozwiązaniem dla ich kasety 10 KD). Pektyna i cukier zawarte w soku zaczęły gromadzić się na membranie w ciągu 30 minut, a pod koniec serii pory membrany zostały częściowo zablokowane, więc uzyskano tylko jedną czwartą oczekiwanego stężenia i trzeba było wymienić kasetę po trzech seriach zamiast po 10. Łącznie oznaczało to znacznie wyższe koszty w przeliczeniu na litr, niż gdyby podzielono koncentrację na dwa przejścia, za każdym razem z mniejszą koncentracją paszy.

Wydajność to kolejny obszar, w którym koncentracja paszy uderza szczególnie w biofarmację, gdzie liczy się każdy gram produktu. Kiedy Twoja pasza jest zbyt skoncentrowana, nie tylko zwiększa się ilość zanieczyszczeń, ale także zaczynasz widzieć utratę produktu na dwa sposoby. Po pierwsze, koncentracyjna warstwa polaryzacyjna może wychwytywać docelowe cząsteczki, a jeśli stanie się zbyt gęsta, cząsteczki te mogą zostać porwane wraz z retentatem podczas opróżniania kasety, zamiast zostać skoncentrowane. Po drugie, niektóre cząsteczki docelowe (takie jak białka) mogą zacząć agregować w wysokich stężeniach, a agregaty te są często wystarczająco małe, aby prześlizgnąć się przez membranę lub utknąć w permeacie, co powoduje ich utratę. Klient zajmujący się wektorami wirusowymi, z którym współpracowałem w zeszłym roku, używał naszej kasety do ultrafiltracji 500 KD do zatężania wektorów AAV — podniósł stężenie w paszy do 1e13 genomów wektorów na ml, co znacznie przekracza nasze zalecenie wynoszące 2e12. Ich wydajność wyniosła zaledwie 45% w porównaniu z 82%, które uzyskano, gdy obniżono koncentrację paszy do odpowiedniego zakresu. Kiedy testowaliśmy retentat, odkryliśmy, że 30% ich wektora docelowego utknęło w warstwie polaryzacji stężenia, a kolejne 15% zostało zagregowane i utracone. To rodzaj trafienia, który może sprawić, że cała partia stanie się bezwartościowa, zwłaszcza gdy masz do czynienia z procesami zgodnymi z GMP, gdzie nie można po prostu wyprodukować większej ilości produktu według kaprysu.

Poczekaj, ale zanim pomyślisz, że „niższa koncentracja paszy jest zawsze lepsza” – to też nie jest prawda. Jeśli Twoja karma jest zbyt rozcieńczona, marnujesz czas i pojemność kasety. UF jest najskuteczniejszy, gdy stężenie roztworu jest rozsądne, ale jeśli zaczniesz od zbyt rzadkiej paszy, przesuniesz znacznie więcej objętości niż jest to konieczne, co zwiększa koszty energii potrzebnej do pompowania i osiągnięcie docelowego stężenia zajmuje więcej czasu. Na przykład klient laboratoryjny zagęszczający małą próbkę białka używał kasety 10KD o stężeniu w paszy 0,1 mg/ml — próbował uzyskać 10 mg/ml, więc przetwarzał 100 ml roztworu, aby uzyskać 10 ml retentatu. Zajęło im to 8 godzin w porównaniu z 2 godzinami, gdy najpierw zatężono paszę poprzez wirowanie do 0,5 mg/ml, więc przetworzyli tylko 20 ml. To ogromna różnica w pracy i czasie, zwłaszcza jeśli uruchamiasz wiele partii dziennie. Kluczem jest trafienie w środkowy zakres – to, co nazywam „oknem koncentracji” dla konkretnej kasety i zastosowania.

Jak więc obliczyć okno koncentracji? Nie jest to reguła uniwersalna, ale istnieje kilka praktycznych zasad, którymi dzielimy się ze wszystkimi naszymi klientami. Najpierw sprawdź MWCO swojej kasety: kaseta o wyższym MWCO (np. 500 KD) zwykle radzi sobie z większym stężeniem surowca niż kaseta o niższym MWCO (np. 30 KD), ponieważ pory są większe, więc polaryzacja nie stanowi większego problemu. NaszSeria kaset-filtracji TFFna stronie podano określone zakresy stężeń dla każdej kasety, ale ogólnie rzecz biorąc, nigdy nie przekraczaj całkowitej zawartości substancji stałych w przypadku większości zastosowań białek i 5–10% w przypadku małych cząsteczek. Po drugie, przetestuj swoją paszę pod kątem zanieczyszczeń: jeśli Twoja pasza zawiera dużo resztek lub kruszyw, potrzebujesz niższego stężenia paszy, aby uniknąć zanieczyszczeń, niezależnie od tego, jaka jest docelowa cząsteczka. Po trzecie, najpierw przeprowadź testy na małą skalę — a nie od razu przechodź do pełnej produkcji. Próba 100 ml lub 1 l powie Ci dokładnie, jaki strumień otrzymasz, jak szybko następuje osadzanie się zanieczyszczeń i jakiej wydajności możesz się spodziewać, dzięki czemu nie marnujesz cennego produktu.

Kolejną rzeczą, którą zauważyłem na przestrzeni lat, jest to, że stężenie surowca wchodzi w interakcję z innymi parametrami procesu, takimi jak natężenie przepływu krzyżowego i ciśnienie transmembranowe (TMP). To nie jest jak dostosowywanie stężenia w próżni – jeśli masz wysokie stężenie nadawy, możesz nieco to skompensować, zwiększając natężenie przepływu krzyżowego, które odsuwa warstwę polaryzacyjną od powierzchni membrany, i zwiększając TMP (ale nie za bardzo, ponieważ TMP może spowodować zagęszczenie warstwy polaryzacyjnej). Jest to jednak działanie równoważące: wyższy przepływ krzyżowy oznacza więcej energii, a wyższy TMP może prowadzić do uszkodzenia membrany, jeśli nie będziesz ostrożny. Zawsze doradzamy klientom wykonanie pełnych badań parametrów uwzględniających stężenie paszy, ponieważ zmiana jednego może zniweczyć pozostałe. Na przykład klient próbował kiedyś naprawić spadek strumienia wynikający z wysokiego stężenia surowca, podkręcając TMP, co skończyło się zagęszczeniem membrany, więc w kolejnych seriach strumień był jeszcze niższy. Dlatego w naszej firmie nie sprzedajemy tylko kaset – pomagamy naszym klientom pokonać te problemy w procesie, ponieważ widzieliśmy prawie każdy błąd, jaki można popełnić przy koncentracji paszy.

Porozmawiajmy także o skutkach długoterminowych, ponieważ koncentracja paszy nie wpływa tylko na pojedynczy cykl – ma wpływ na żywotność kasety. Jeśli używasz zbyt skoncentrowanej paszy, tworzysz znacznie więcej zanieczyszczeń, co oznacza, że ​​musisz częściej czyścić kasetę i używać bardziej agresywnych środków czyszczących (takich jak wyższe pH lub temperatura), aby pozbyć się osadów. Z biegiem czasu to agresywne czyszczenie powoduje degradację membrany, dlatego kaseta ma mniej przebiegów, zanim będzie konieczna wymiana. Miałem klienta, który korzystał z naszej kasety z płaskim arkuszem i po piątym przebiegu musiał ją wymienić z powodu silnego zanieczyszczenia, podczas gdy inny klient korzystający z tej samej kasety przy odpowiednim stężeniu paszy uzyskał ponad 15 przebiegów. To ogromna różnica w kosztach, gdy przeglądasz kasety co tydzień w porównaniu z comiesięcznym.

A teraz przejdźmy do praktyki — co właściwie powinieneś zrobić, jeśli koncentracja paszy jest nieprawidłowa? Najpierw dobrze to zmierz. Wielu klientów kieruje się „wizualną grubością” rozwiązania, co jest bardzo niedokładne. Aby uzyskać dokładne stężenie, użyj miernika Brixa w przypadku produktów spożywczych lub absorbancji (np. A280 w przypadku białek). Następnie dostosuj paszę, rozcieńczając ją (jeśli jest zbyt wysoka) lub zagęszczając ją dalej, wykonując mniejszy etap wstępnej obróbki (np. filtracja z przepływem stycznym za pomocą innej kasety lub wirowanie), jeśli jest zbyt niska. Jeśli masz do czynienia z paszą jedyną w swoim rodzaju, np. niestandardową paszą biologiczną, skontaktuj się z naszym zespołem — mamy specjalistów ds. zastosowań, którzy pomogą Ci zaprojektować proces dostosowany do stężenia paszy, niezależnie od tego, czy będzie to wybór odpowiedniego MWCO (np. 30 KD vs. 500 KD), dostosowanie przepływu krzyżowego czy znalezienie najlepszego czasu działania.

Nie mogę wystarczająco podkreślić, jak wiele drobnych poprawek w celu koncentracji paszy może zmienić cały proces UF. To nie jest nudny szczegół — to różnica między serią, w wyniku której osiągnięto wszystkie cele związane z wydajnością i harmonogramem, a serią, w wyniku której przez wiele dni będziesz musiał rozwiązywać problemy, marnując produkt i pieniądze. Zbudowaliśmy naszeUltrafiltracja kasetowalinia ma być elastyczna, z opcjami dla różnych MWCO (takich jak naszeKasety ultrafiltracyjne 30 kdIKasety ultrafiltracyjne 500KD), projekty płaskich arkuszy i konfiguracje serii TFF, ponieważ wiemy, że pasza każdego klienta jest inna. Jeśli zmagasz się z problemami związanymi z koncentracją paszy lub po prostu chcesz zwiększyć wydajność procesu UF, jesteśmy tutaj, aby Ci pomóc — współpracowaliśmy z tysiącami klientów, aby uzyskać odpowiednie okna koncentracji i możemy zrobić to samo dla Ciebie. Nie pozwól, aby taki drobny szczegół, jak koncentracja paszy, zrujnował Twoje przebiegi — już dziś skontaktuj się z naszym zespołem, aby dowiedzieć się więcej o optymalizacji procesu.

Referencje

1. Belfort, G., Davis, RH i Zydney, AL (1994). Zachowanie zawiesin i roztworów wielkocząsteczkowych w mikrofiltracji krzyżowej. Journal of Membrane Science, 96 (1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Polaryzacja hydrodynamiczna i stężeniowa w ultrafiltracji: przegląd. Odsalanie, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Filtracja z przepływem stycznym do przetwarzania biofarmaceutycznego. Aktualna opinia w inżynierii chemicznej, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Podstawowe zasady technologii membranowej (wyd. 2). Wydawnictwo Akademickie Kluwer.