Jak wybrać odpowiednią rurkę ultrafiltracyjną?

W probówkach do ultrafiltracji często stosuje się probówki do ultrafiltracji powszechnie używane do zatężania białek i wymiany buforu. Istnieją inne modele, które mają różne rozmiary objętości i rurki ultrafiltracyjne, w zależności od masy cząsteczkowej białka docelowego, objętości przed stężeniem i docelowej objętości stężenia. Wielokrotnego użytku.

1. Wybierz odpowiednią rurkę ultrafiltracyjną, biorąc pod uwagę głównie MWCO i objętość stężenia. Ogólnie masa cząsteczkowa nie powinna być większa niż 1/3 masy cząsteczkowej białka docelowego. Jeżeli masa cząsteczkowa białka docelowego wynosi około 10 kD, można zastosować probówkę do ultrafiltracji z zatrzymaną masą cząsteczkową 3 kD.

2. Nowo zakupiona ultrafiltracja jest sucha. Dodaj miliq wody przed użyciem. Woda przechodzi całkowicie przez membranę i jest wstępnie schładzana w łaźni lodowej lub lodówce przez kilka minut. Następnie wylej wodę, aby dodać roztwór białka. Ilość roztworu białka nie powinna przekraczać białej linii na górze probówki. Łatwa operacja. Przed dodaniem roztworu białka rurkę ultrafiltracyjną należy włożyć do lodu w celu wstępnego schłodzenia.

3. Równowaga. Masa i środek ciężkości muszą być zrównoważone. Należy pamiętać, że prędkość i przyspieszenie nie powinny być zbyt szybkie, w przeciwnym razie membrana ultrafiltracyjna zostanie bezpośrednio uszkodzona. Rozpocznij ultrafiltrację wirówkową (wstępne schłodzenie wirówki do 4 stopni). Kierunek membrany i obracającego się wału można regulować zgodnie z instrukcją (w przypadku wirówki kątowej membrana jest prostopadła do wału). W rzeczywistym użytkowaniu ogólna prędkość jest niższa niż określona w instrukcji, co może wydłużyć żywotność rury odśrodkowej.

4. po zagęszczeniu do pozostałego 1 ml [weź 50ul domowego roztworu Bradforda, dodaj 10ul płynu, aby zobaczyć, czy zmieni kolor na niebieski i sprawdź, czy z probówki ultrafiltracyjnej wycieka białko. Jeśli rurka przecieka, wlej ją do górnej warstwy, a następnie przepłyń z powrotem do nowej rurki, aby rozpocząć ultrafiltrację. Aby dokładnie określić, czy probówka przecieka, należy odwirować 5mg 10min 10min, następnie przepuścić, przepuścić żel białkowy lub Bradford] [pomiar zgrubny]. Kontynuuj dodawanie pozostałego roztworu białka w celu zatężenia (operuj na lodzie, aby zapobiec nagrzewaniu się białka), aż wszystkie stężone roztwory zostaną dodane. Podczas wirowania należy zwrócić uwagę, czy nie dochodzi do wytrącania białka i czy nie powoduje zablokowania probówki. W przypadku wystąpienia wytrącania należy określić konkretną przyczynę wytrącania, czy stężenie białka jest zbyt wysokie lub czy bufor jest nieodpowiedni; Pierwsze rozwiązanie można rozwiązać, stosując wiele probówek do ultrafiltracji w tym samym czasie, aby zmniejszyć stężenie, podczas gdy drugie może zmieniać różne bufory, aż białko się wytrąci.

5. Poprzednie kroki służą do zagęszczania białka. Jeśli bufor ma zostać wymieniony, gdy całkowity roztwór białka zostanie zatężony do około 1 ml, delikatnie dodaj nowy bufor (ultrafiltracja przez membranę ultrafiltracyjną 0.22um), a następnie w sposób ciągły zagęszczaj do około 1 ml trzy razy, tak że końcowe stężenie zależy od wymaganego stężenia białka, które zwykle nie przekracza 500ul lub mniej niż 200ul. Według stężenia objętościowego co najmniej 10 razy za każdym razem jest to ponad 1000 razy więcej niż trzy razy, co może w zasadzie osiągnąć cel zmiany bufora.

6. Usuń końcowy koncentrat białkowy. Działaj na lodzie. Używając żółtej końcówki pipety (200ul), delikatnie włóż końcówkę pipety wzdłuż krawędzi, następnie delikatnie przedmuchaj i wymieszaj roztwór białka. Uważaj, aby nie dotknąć membrany ultrafiltracyjnej. Zassać stężony roztwór za każdym razem do 200ul, aż zostanie całkowicie odessany. Nie jest konieczne ekstrahowanie ostatniego stężonego roztworu na dnie probówki, w przeciwnym razie jest to zbyt trudne i membrana ultrafiltracyjna może ulec uszkodzeniu. Na koniec do rurki ultrafiltracyjnej dodaje się wodę milliq bez przechodzenia przez membranę ultrafiltracyjną, aby zapobiec utracie wody i wysuszeniu membrany.

7. Poniżej przedstawiono etapy obróbki rury ultrafiltracyjnej i ponownego użycia rury ultrafiltracyjnej.

8. Wlej wodę do rurki ultrafiltracyjnej i delikatnie kilkakrotnie spłucz wodą miliq. [jeśli na dnie probówki wyraźnie wytrąca się białko, możesz najpierw dodać wodę, a następnie zdmuchnąć ją pipetą. Uważaj, aby nie dotknąć membrany. Osad zwisa, a następnie ucieka. Nie możesz go spłukać wodą z kranu. Po dodaniu 0,2 m roztworu NaOH, umieść go w temperaturze pokojowej na 20 minut iw tym czasie zrównoważyć probówkę ultrafiltracyjną. Wiruj przez kolejne 10 minut. Wylej pozostały roztwór NaOH i zanurz bawełniany rdzeń w zlewce (1 lub 2L) wody Milliq, umieszczonej na kilka godzin, a następnie zastąp nową wodą, umieszczaną na kilka godzin w celu ciągłego rozcieńczania stężenia NaOH. Umyj probówkę 50 ml i zalej wodą z kranu, a wewnętrzną ściankę przemyj wodą miliq.

9. Wyjmij zanurzony rdzeń probówki, dodaj go do pełnej wody miliq, a następnie napełnij probówkę 50 ml wodą miliq. Powoli włóż rdzeń tubki do 50ml.

Odwiruj probówkę, odcedź i podziel wodę, a następnie przykryj i przechowuj w temperaturze 4 stopni do następnego użycia. Ogólnie rzecz biorąc, zgodnie z powyższymi krokami i środkami ostrożności, każda rurka nie pęknie w ciągu trzech lub czterech lat.