Środki ostrożności dotyczące stosowania rurki ultrafiltracyjnej
(1) Wybierz odpowiednią rurkę ultrafiltracyjną. Ogólnie masa cząsteczkowa, która ma zostać zachowana, nie powinna być większa niż 1/3 masy cząsteczkowej białka docelowego. Na przykład, jeśli masa cząsteczkowa białka docelowego wynosi 35 kDa, można wybrać probówkę do ultrafiltracji o masie cząsteczkowej 10 kDa. Jeśli masa cząsteczkowa białka docelowego wynosi około 10 kD, można zastosować probówkę ultrafiltracyjną o masie cząsteczkowej 3 kD. Uważnie przeczytaj instrukcję obsługi i zwróć uwagę na różną tolerancję membrany ultrafiltracyjnej na różne chemikalia.
(2) Nowo zakupiona ultrafiltracja jest sucha. Dodaj wodę ultraczystą przed użyciem, a woda całkowicie przepłynie przez membranę. Wstępnie schłodzić w łaźni lodowej lub lodówce przez kilka minut. Następnie wylej wodę i dodaj roztwór białka. Dodana ilość nie może przekraczać białej linii na górze tuby. Operacja powinna być lekka. Przed dodaniem roztworu białka rurkę ultrafiltracyjną należy umieścić na lodzie w celu wstępnego schłodzenia.
(3) Równowaga. Należy zrównoważyć zarówno masę, jak i środek ciężkości. Należy pamiętać, że prędkość i przyspieszenie nie powinny być zbyt szybkie, w przeciwnym razie membrana ultrafiltracyjna zostanie bezpośrednio uszkodzona. Rozpocznij ultrafiltrację odśrodkową (wstępne chłodzenie wirówki do 4 stopni). Po przeliczeniu obrotów różnych wirówek na G jest inaczej. Ustaw przyspieszenie wirówki na najniższy bieg, aby zmniejszyć nacisk na membranę. Zwróć uwagę, że przed opuszczeniem wirówki musisz poczekać, aż wirówka osiągnie docelową prędkość, w przeciwnym razie, gdy wystąpi problem z wirówką, nie możesz sobie z tym poradzić za pierwszym razem. Kierunek membrany i wału obrotowego należy wyregulować zgodnie z instrukcją (w przypadku wirówki kątowej membrana jest prostopadła do wału). W praktyce prędkość jest zwykle niższa niż w instrukcji, co może przedłużyć żywotność rury odśrodkowej.
(4) Gdy zostanie skoncentrowany do pozostałego 1ml, weź 50ul roztworu buforowego i dodaj 10ul, aby przepłynąć, aby zobaczyć, czy zmieni kolor na niebieski, aby ocenić, czy z probówki ultrafiltracyjnej wycieka białko. Jeśli rurka przecieka, wylej górną warstwę i przepłyń przez nową rurkę i rozpocznij ultrafiltrację. Aby dokładnie ocenić, czy probówka przecieka, odwiruj z 5 mgml BSA przez 10 minut, następnie przepuść, użyj kleju białkowego lub Bradforda w celu zgrubnego pomiaru i kontynuuj dodawanie pozostałego roztworu białka w celu zatężenia (operuj na lodzie, aby zapobiec ogrzewane) aż do dodania wszystkich stężonych roztworów. Zwróć uwagę, czy podczas wirowania dochodzi do wytrącania białka, co powoduje zablokowanie rur. Jeśli nastąpi wytrącenie, określ konkretną przyczynę wytrącania, czy stężenie białka jest zbyt wysokie lub bufor jest nieodpowiedni; To pierwsze można rozwiązać przez równoczesną ultrafiltrację z wieloma rurkami ultrafiltracyjnymi w celu zmniejszenia stężenia. Ta ostatnia polega na zmianie różnych roztworów buforowych, aż białko się nie wytrąci.
(5) Poprzednie kroki służą do koncentracji białka. Jeśli chcesz zmienić bufor, gdy cały roztwór białka zostanie zatężony do około 1ml, delikatnie dodaj nowy bufor (ultrafiltracja przez membranę 0.22um do ultrafiltracji), a następnie zatęż do około 1ml trzy razy z rzędu. Ostateczna objętość ostatniego stężenia zależy od wymaganego stężenia białka, które zazwyczaj nie przekracza 500ul lub może być skoncentrowane do mniej niż 200ul. Zgodnie ze stężeniem objętościowym co najmniej 10 razy za każdym razem może osiągnąć ponad 1000 razy trzy razy, co może w zasadzie osiągnąć cel zmiany bufora.
