StosowanieUltrafiltracja wExtrakcjaNnaturalnyCkolagen

 

Ⅰ.Co to jest kolagen

Kolagen to biopolimer, główny składnik tkanki łącznej zwierząt, a także najobficiej i najbardziej rozpowszechnione białko funkcjonalne u ssaków, stanowiące 25–30% białka całkowitego, a w niektórych przypadkach nawet ponad 80%. organizmy. Odgrywa rolę wiążącą tkankę w komórkach zwierzęcych.

Z pomiaru wynika, że ​​dorosły człowiek ma w organizmie około 3 kg kolagenu, który występuje głównie w skórze, kościach, oczach, zębach, ścięgnach, narządach wewnętrznych (m.in. sercu, żołądku, jelitach, naczyniach krwionośnych) i innych częściach ciała. ludzkiego ciała. Jego funkcją jest utrzymanie morfologii i struktury skóry i narządów, jest także ważnym surowcem do naprawy uszkodzonych tkanek.

II. Ekstrakcja kolagenu z łuski karpia trawiastego metodą ultrafiltracji

1. Materiały i metody

1.1 Próbki testowe

Wodny ekstrakt surowego kolagenu.

1.2 Metody badań

1.2.1 Proces ultrafiltracji

1.2.2 Oznaczanie procesu filtracji wstępnej

W badaniu tym optymalny proces filtracji wstępnej wyznaczany jest poprzez analizę porównawczą metody filtracji próżniowej i metody mikrofiltracji. Konkretne metody badań są następujące:

① Surowy ekstrakt wodny kolagenu filtruje się metodą filtracji próżniowej na bibule filtracyjnej w celu usunięcia zawieszonych cząstek i zanieczyszczeń w ekstrakcie wodnym.

② Surowy ekstrakt wodny kolagenu filtruje się przez membranę mikrofiltracyjną 0,2 μm w celu usunięcia nierozpuszczalnych substancji, zanieczyszczeń itp. z ekstraktu wodnego.

1.2.3 Wybór wielkości porów membrany ultrafiltracyjnej

Podczas oczyszczania wielkość porów membrany ultrafiltracyjnej wynosi 100 kDa.

1.2.4 Doświadczenie jednoczynnikowe procesu oczyszczania ultrafiltracyjnego

Wodny ekstrakt surowego kolagenu oczyszczany jest metodą ultrafiltracji. Zbadaj jednoczynnikowy eksperyment dotyczący wpływu ciśnienia roboczego, temperatury roboczej i pH na retencję kolagenu. Po uruchomieniu sprzętu do ultrafiltracji na pewien czas zbadaj wpływ różnych czynników na szybkość zatrzymywania kolagenu.

1.2.5 Wzór obliczeniowy

2. Wyniki i analiza

2.1 Analiza procesu przedfiltracji

W poniższej tabeli przedstawiono wyniki porównania metody filtracji próżniowej i metody mikrofiltracji.

Metoda filtracji	Stężenie roztworu przed filtracją/(g/l)	Stężenie roztworu po filtracji/(g/l)	Zjawiska sensoryczne
metoda filtracji próżniowej	0.45	0.35	Roztwór jest klarowny pod koniec filtracji, lecz po pewnym czasie staje się mętny.
metoda mikrofiltracji	0.45	0.42	Roztwór jest klarowny pod koniec filtracji i pozostaje klarowny po pewnym czasie

 

Z tabeli widać, że zarówno metoda filtracji próżniowej, jak i metoda mikrofiltracji mogą usunąć zanieczyszczenia i nierozpuszczalne ciała stałe z roztworu, ale metoda mikrofiltracji ma lepszy wpływ na ochronę białka, to znaczy strata nie jest znacząca, i metoda filtracji próżniowej może powodować straty białka. Ponadto filtrat jest mętny po umieszczeniu go na pewien czas w filtracji próżniowej, podczas gdy mikrofiltracja jest nadal klarowna i przezroczysta, dlatego mikrofiltrację wybiera się jako proces obróbki wstępnej ultrafiltracji.

2.2 Test jednoczynnikowy procesu ultrafiltracji

2.2.1 Wpływ ciśnienia ultrafiltracji na stopień retencji

W temperaturze 40 stopnia i pH 9.0 zbadaj wpływ różnych ciśnień ultrafiltracji (0.07 MPa, 0.{ {11}}9 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa i 0,15 MPa) na współczynnik retencji białka. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

 

Jak widać z powyższego rysunku, wraz ze wzrostem ciśnienia roboczego, szybkość przechwytywania białka stopniowo malała. Przy {{0}}.07 MPa stopień retencji białka wynosi 96,53%, przy ciśnieniu roboczym 0,15 MPa współczynnik retencji białka wynosi 84,38%. Dzieje się tak dlatego, że rozdział substancji metodą ultrafiltracji napędzany jest różnicą ciśnień. W tym zakresie niskiego ciśnienia roboczego drobnocząsteczkowa substancja może szybko przejść przez membranę, ale wielkocząsteczkowe substancje mogą zostać wyłapane przez membranę ultrafiltracyjną i gromadzić się na powierzchni membrany, a w tym momencie na powierzchni membrany i cieczy ekstrakt z różnicy stężeń powoduje różnicę stężeń, odporność na polaryzację; jednakże wraz ze wzrostem ciśnienia opór polaryzacji stężenia stopniowo wzrasta, a różnica stężeń pomiędzy powierzchnią membrany a ekstraktem wodnym osiąga równowagę. Gdy ciśnienie przekroczy tę równowagę, na powierzchni membrany można zapisać warstwę żelu (co jest zgodne z teorią polaryzacji stężeniowej i warstwy żelu powstającej podczas ultrafiltracji). Ciśnienie w dalszym ciągu rośnie, zwiększa się grubość warstwy żelu i zwiększa się ilość białka pozostającego na powierzchni membrany, co skutkuje niskim współczynnikiem retencji. Aby zapewnić efekt separacji membrany, optymalny parametr ciśnienia roboczego wynosi 0,07 MPa.

2.2.2 Wpływ temperatury na szybkość retencji białek

Pod ciśnieniem {{0}},11 MPa, pH 9,0, zbadaj wpływ różnych temperatur (25 stopni, 30 stopni, 35 stopni, 40 stopni i 45 stopni) na retencję białka. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

 

Jak pokazano na powyższym rysunku, wraz ze wzrostem temperatury stopień retencji membrany ultrafiltracyjnej stopniowo wzrasta i osiąga maksimum w temperaturze 45 stopni, przy współczynniku retencji wynoszącym 97,01%. Ponieważ lepkość kolagenu jest ściśle powiązana z temperaturą: im niższa temperatura, tym lepkość kolagenu jest większa, a zatem kolagen łatwo tworzy opór na powierzchni membrany, co skutkuje niskim współczynnikiem retencji. Gdy temperatura wzrasta, lepkość kolagenu maleje i oddziaływanie między cząsteczkami kolagenu ulega osłabieniu, w związku z czym zwiększa się szybkość przenoszenia masy i osłabia się polaryzacja stężenia, zwiększając w ten sposób stopień retencji. Inną przyczyną wzrostu współczynnika retencji jest wzrost temperatury, w związku z czym zwiększa się rozpuszczalność kolagenu i zmniejsza się zjawisko blokowania błony przez kolagen. Dlatego optymalna temperatura ultrafiltracji wynosi 45 stopni.

2.2.3 Wpływ pH na retencję białek

W warunkach ciśnienia {0}.11 MPa i temperatury 40 stopnia zbadaj wpływ różnych warunków pH, a mianowicie pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 i pH=10.0, na współczynnik retencji. Wyniki pokazano na poniższym rysunku.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, stopień retencji wzrasta stopniowo wraz ze wzrostem pH. Dzieje się tak, ponieważ membrana ultrafiltracyjna to membrana z klonu polieterowego o ładunku ujemnym, kolagen z ładunkiem ujemnym w warunkach zasadowych, ujemnie naładowane cząsteczki kolagenu i membrana ultrafiltracyjna o tym samym ładunku tworzą wzajemnie wykluczający się stan, w związku z czym cząsteczki kolagenu nie są łatwe do utrzymania na powierzchni membrany, nie jest łatwo zablokować membranę, dlatego optymalne pH ultrafiltracji wynosi 8-10.

2.3 Optymalizacja procesu ultrafiltracji i walidacja wyników

Analiza przeprowadzona za pomocą oprogramowania Design-Expert8.05 pokazuje, że optymalne parametry procesu to: ciśnienie robocze 0,14 MPa, temperatura robocza 40,98 stopnia i pH roztworu=9,43. W tych warunkach wskaźnik retencji wyniósł 92,551%. Biorąc pod uwagę funkcjonalność rzeczywistych parametrów, ciśnienie robocze wynosi 0,14 MPa, temperatura robocza wynosi 40 stopni, a wartość pH cieczy zasilającej wynosi 9,50 w warunkach ultrafiltracji. Weryfikację eksperymentalną rozpoczyna się po uruchomieniu stabilnego układu urządzenia ultrafiltracyjnego. Uzyskany wynik wskaźnika retencji wynosi (92,61 0,1)% (n=3). Przewidywana wartość równania jest w zasadzie zbliżona do wartości zmierzonej, co oznacza, że ​​przewidywany wynik parametru warunkowego jest zgodny z rzeczywistym wynikiem warunkowym.

2.4 Wyniki analizy elektroforetycznej

Oczyszczony kolagen analizuje się metodą elektroforezy SDS-PAGE, a wyniki przedstawiono na rysunku poniżej.

Jak pokazano na powyższym rysunku, ścieżka 1 to oczyszczony kolagen w tym doświadczeniu, a ścieżka 2 to standardowa próbka kolagenu ze ścięgna łydki. Z elektroforezy SDS-PAGE można było zobaczyć, że białko kolagenowe zaproponowane w tym doświadczeniu można zidentyfikować jako kolagen, ale pozornie niewyraźne granice łańcucha peptydowego a1 i łańcucha peptydowego a2 nie są jasne. Z elektroforezy jasno wynika, że ​​nie ma innych prążków białkowych i można stwierdzić, że czystość oczyszczonego kolagenu jest wysoka.